Amyotrofisk lateralskleros och det medfödda immunsystemet

Amyotrofisk lateralskleros (ALS) är en progressiv, dödlig, neurodegenerativ sjukdom som påverkar de övre och nedre motorneuronerna. Detta leder till djupgående muskeldystrofi, hyperreflexi, fascikulationer och pareser av såväl bulbar som skelettmuskulaturen. ALS orsakar ökande fysisk trötthet och patienterna blir snart sängliggande och andningssvårigheter. Diagnosen ALS ställs enligt El Escorial revisited. Ofta måste kliniska och neurofysiologiska tester upprepas (1-4).

I Danmark är förekomsten av ALS 1-2/100 000 och prevalensen är 4-6/100 000. Den genomsnittliga överlevnadstiden från tidpunkten för diagnosen är 3 år men med stor varians. (5+6)

Idag är patogenesen fortfarande okänd och ingen behandling kan stoppa utvecklingen av ALS. Behandling med riluzol verkar förlänga mediantiden för överlevnad i 2 eller 3 månader (7).

Troligtvis kräver en framtida medicinsk behandling en bättre förståelse av patogenesen såväl som patofysiologin för ALS. Denna studie syftar till att göra det baserat på hypotesen att ALS delvis eller helt orsakas av komplementaktivering.

Komplementsystemet är ett komplext system bestående av proteiner i plasma samt membranbundna proteiner som tillsammans kompletterar det antikroppsbaserade immunförsvaret. Komplementsystemet är ett självförevigande kaskadsystem som aktiveras genom olika vägar. Det fungerar genom opsonisering där komplementproteiner binder till mikroorganismer för att aktivera och rikta granulocyter, monocyter och makrofager. Komplementsystemet orsakar även cytolys av mikroorganismer via MAC (membranattackkomplex) genom aktivering av mastcellerna. Det inaktiverar och eliminerar också utbrända immunkomplex samt utför apoptotisk renovering.

En nyligen genomförd pilotstudie av Neuromyelit Optica har visat hur komplementsystemet spelar en central roll i patogenesen av en sjukdom som tidigare felaktigt uppfattades som ett tidigt stadium av disseminerad skleros. Dessa fynd resulterade i medicinsk behandling med antikomplement (equlizumab) med lovande resultat (8). Det är möjligt att liknande patogenetiska mekanismer kan vara den molekylära grunden för ALS.

Olika forskargrupper har försökt belysa hur immunförsvaret är involverat i utvecklingen av ALS (9-35). Flera studier stödjer hypotesen att komplementsystemet är av avgörande betydelse för uppkomst och progression av ALS. (9-28)

I flera kliniska prövningar med ALS-plasma dras slutsatsen att ALS-plasma är cytotoxiskt när det inkuberas med friska röda blodkroppar eller frisk nervvävnad. Viss forskning tyder på att cytotoxiciteten orsakas av komplementsystemet. Resultaten kan dock inte reproduceras i alla kliniska prövningar. Dessa försök utfördes för decennier sedan där metoderna för att detektera komplementaktivitet var begränsade. (9-14)

Flera djurförsök tyder på att ALS startar i de neuromuskulära junctions (NMJ) och därför bör betraktas som en distal axonopati snarare än en central neurologisk sjukdom, vilket idag är den allmänna uppfattningen av ALS. (27-31)

Syftet med projektet Syftet är att öka kunskapen om patofysiologin för sjukdomen ALS då detta möjligen kan leda oss närmare en riktad medicinsk behandling.

Projektgruppen vill undersöka om en tidigare funnen, unik cytotoxicitet i ALS-plasman kan återfinnas (9-14). Om så är fallet, så gör dagens moderna metoder det möjligt att upptäcka om immunsystemet i allmänhet, och i synnerhet komplementsystemet, orsakar denna cytotoxicitet.

Etableringen av ett nationellt forskningsprojekt om ALS och komplementsystemet genom att göra en forskningsbiobank med systematiskt insamlat blod och ryggmärgsvätska från ALS-patienter från hela landet ska säkerställa möjligheten att ta reda på om komplementsystemet spelar roll för uppkomsten. och progression av ALS.

Vidare kommer en pilotstudie att genomföras i syfte att undersöka om det finns komplementaktivitet i NMJ hos patienter med ALS som det har visats i en studie på ALS-möss. (28)

Hypoteserna

1. ALS kännetecknas av ett onormalt immunsvar med cytotoxicitet och ökad komplementaktivitet i plasma som avslöjas av följande:

   1. Plasma från patienter med ALS visar ökad hemolytisk aktivitet när det inkuberas med röda blodkroppar från friska försökspersoner.
   2. Komplementaktiviteten är ökad i plasma från ALS-patienter jämfört med plasma från neurologiskt friska försökspersoner och försökspersoner med annan neurologisk sjukdom.
   3. Den hemolytiska aktiviteten i plasma från ALS-patienter är korrelerad med komplementaktiviteten.
2. Spinalvätska från ALS-patienter innehåller ökad komplementaktivitet jämfört med spinalvätska från neurologiskt friska försökspersoner och från försökspersoner med annan neurologisk sjukdom.

Patienter, material och metoder:

Klinisk prövning 1(CT1): Hemolytisk aktivitet och komplementsystemet i ALS-plasma

Antal försökspersoner: 25 patienter med ALS, 25 patienter med annan neurologisk sjukdom, 25 friska frivilliga

Förloppet av CT1: Ett blodprov tas från varje patient. De röda blodkropparna och den flytande delen av blodet, plasman, separeras. De röda blodkropparna från olika försökspersoner inkuberas i en annan individs plasma. Samma provförlopp upprepas efter inaktivering av det föreliggande komplementsystemet både genom värme och genom antikomplement.

Klinisk prövning 2(CT2): Fallkontrollstudie som syftar till att kartlägga komplementsystemet

Antal försökspersoner: 100 patienter med ALS, 100 patienter med annan neurologisk sjukdom och 100 neurologiskt friska patienter

Förloppet av CT2:Blodprover och cerebrospinalvätska förbereds och fryses sedan in i en forskningsbiobank. Därefter analyseras och jämförs proverna från de 3 grupperna av försökspersoner med fokus på komplementsystemet: Komplementaktiveringspotentialen mäts i det biologiska materialet. En cytokinprofil görs såväl som kartläggning av akutfasreaktanterna genom multiplexanalyser. Vidare görs RNA-expressionsprofilen på en cellpellet stabiliserad med RNA senare.

Klinisk prövning 3(CT3): ALS-patienters komplementsystem över tid - en kohortstudie Antal försökspersoner:20 patienter med ALS (undergrupp från CT2)

Kursen för CT3: Var sjätte månad upprepas kursen från CT2. Aktiviteten hos komplementsystemet hos varje patient med ALS analyseras allteftersom sjukdomen fortskrider.

Klinisk prövning 4(CT4): Sökande efter komplementaktivitet i NMJ hos ALS-patienter

Antal försökspersoner:10 patienter med ALS

Förloppet av CT4: Muskelbiopsierna tas och förs omedelbart till avd. i patologi vid Rigshospitalet. Därefter färgas tunna lager av vävnad för att analysera muskelfibrerna och NMJ samt detektera närvaron av komplementaktivitet.

Genomförande av studien Projektet består av fyra kliniska prövningar. Inkludering av försökspersonerna görs tillsammans med personal på ALS-polikliniker på sjukhus över hela landet och försökspersoner för kontrollgrupperna ingår enligt listan över inklusionsplatser nedan.

Webbplatser för inkludering:

ALS-poliklinik, Neurologisk klinik, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Kontaktperson: Överläkare Elisabeth Elmo Neurologiska kliniken, Rigshospitalet Glostrup (neurologisk kontrollgrupp, CT1+2) Kontaktperson: Professor, överläkare, dr.med. Rigmor Højland Jensen Neurokirurgisk klinik, Rigshospitalet (neurologisk kontrollgrupp, CT2) Kontaktperson: Professor, överläkare, dr.med. Marianne Juhler ALS-poliklinik, Neurologisk avdelning, Bispebjerg Hospital (CT2) Kontakt: Överläkare Merete Karlsborg ALS-poliklinik, Neurologisk avdelning, Roskilde sjukhus (CT2 + 3) Kontakt: Överläkare Helle Thagesen ALS-poliklinik, Neurologisk avdelning, Odense Universitetssjukhus (CT2) Kontaktperson: Överläkare, dr.med. Matthias Bode ALS-poliklinik, Neurologisk Avdelning, Århus sjukhus, Nørrebrogade (Klinisk prövning 2) Kontaktperson: Överläkare, ph.d. Anette Torvin Gildhøj Privatsjukhus, Brøndby (neurologiskt frisk kontrollgrupp, klinisk prövning 2) Kontaktperson: Anestesiläkare Niels Anker Pedersen

Effektberäkningar CT1: Hemolytisk aktivitet och komplementsystemet i ALS-plasma Studien Overgaard et al. (18) fann en medelskillnad på cirka 0,20 (SE 0,052 i ALS-gruppen, N=20, SD 0,22) i absorbansen (415 nm och 5 timmars inkubation) mellan ALS-patienter och friska bioanalytiker. Med α=0,05 och beta=0,20 motsvarande potens 0,80 måste vi inkludera 21 ämnen. Som möjliga avhopp och tekniskt misslyckade anses test som utredarna väljer att inkludera 25 försökspersoner i varje grupp. (36)

CT2: Fall-kontrollstudie som kartlägger komplementsystemet Antalet försökspersoner i varje grupp är i denna fall-kontrollstudie beräknat med α=0,05. Utredarna jämför komplementaktiveringspotentialen för 3 grupper med samma mängd försökspersoner i varje. Hos friska försökspersoner är komplementaktiveringspotentialen 100 % med en normal yta som sträcker sig från 50-150 % och där prevalensen av låg komplementaktiveringspotential (under 50 %) är under 10 %. Med power =0,80 beräknas det vara nödvändigt att inkludera 100 försökspersoner i varje grupp. Härigenom är det möjligt att finna statistiskt signifikanta skillnader mellan grupperna motsvarande en oddskvot på 2,3, vilket skulle motsvara att 20 % av ALS-patienter har en låg komplementaktiveringspotential orsakad av ökad komplementaktivitet. (36)

CT3: ALS-patienters komplementsystem över tid - en kohortstudie Detta är en hypotesgenererande studie. Det förväntas att de inkluderade 20 ALS-patienterna i denna kohort kommer att vara en undergrupp från Clinical Trial 2. Som kontrollgrupp vid baslinjen kommer den neurologiskt friska kontrollgruppen från Clinical Trial 2 att användas.

CT4: Sökning efter komplementaktivitet i NMJ hos ALS-patienter Det finns inga tidigare studier som beskriver komplementaktiviteten i NMJ hos levande människor. Det är därför inte relevant att göra en effektberäkning.

Databearbetning CT1: Hemolytisk aktivitet och komplementsystemet i ALS-plasma Jämförelse av graden av hemolys mellan ALS-patienterna och kontrollgrupperna t-test och envägs ANOVA används. För att beräkna gränsvärdena använder utredarna kurvor för mottagarens funktionskarakteristik (ROC).

CT2: Fall-kontrollstudie som kartlägger komplementsystemet Jämför koncentrationen av komplement och komplementaktiveringspotentialen mellan ALS-patienter och kontrollgrupperna t-test och envägs ANOVA används. För att beräkna oddsen för låg komplementaktiveringspotential i ALS-gruppen jämfört med kontrollgrupperna använder utredarna logistisk regression. För att beräkna gränsvärdena används mottagarens funktionskarakteristik (ROC) kurvor.

CT3: ALS-patienters komplementsystem över tid - en kohortstudie Som i Clinical Trial 2. Vidare är regressionsanalys av komplementaktiviteten som funktion av tiden sedan ALS debut, kön, ålder, undertyp av sjukdom och sjukdomsprogression. genomfördes.

CT4: Söker efter komplementaktivitet i NMJ hos ALS-patienter Som i CT2. Graden av komplementdeposition och muskelpatologi beskrivs kvalitativt och en blind poängsättning i "normal", "lätt grad" och "svår grad" av förändringar genomförs. Detta kommer att jämföras kvantitativt med 2 x K-tabeller och icke-parametrisk statistik.

Spridning av resultat Projektets resultat kommer att publiceras i internationella peer reviewed, tidskrifter. Både positiva och negativa resultat kommer att publiceras.

Perspektiv Med etableringen av en stor nationell ALS-forskningsbiobank kommer det att vara möjligt att genomföra många framtida forskningsprojekt. Kontinuerlig forskning inom ALS är avgörande för ALS-patienter nationellt såväl som internationellt för att behålla hoppet om en effektiv medicinsk behandling för denna aggressiva sjukdom som finns i framtiden.