Stwardnienie zanikowe boczne i wrodzony układ odpornościowy

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) to postępująca, śmiertelna choroba neurodegeneracyjna, która atakuje górne i dolne neurony ruchowe. Prowadzi to do głębokiej dystrofii mięśniowej, hiperrefleksji, drżenia pęczkowego i niedowładu mięśni opuszkowych i szkieletowych. ALS powoduje narastające zmęczenie fizyczne, a pacjenci szybko stają się przykuci do łóżka i mają niewydolność oddechową. Diagnozę ALS stawia się na podstawie powtórnej wizyty w El Escorial. Często konieczne jest powtórzenie badań klinicznych i neurofizjologicznych (1-4).

W Danii zapadalność na ALS wynosi 1-2/100 000 a częstość występowania wynosi 4-6/100 000. Średni czas przeżycia od momentu rozpoznania wynosi 3 lata, ale z dużą zmiennością. (5+6)

Obecnie patogeneza jest nadal nieznana i żadne leczenie nie może zatrzymać postępu ALS. Wydaje się, że leczenie riluzolem wydłuża medianę czasu przeżycia o 2 lub 3 miesiące (7).

Najprawdopodobniej przyszłe leczenie medyczne wymaga lepszego zrozumienia patogenezy, a także patofizjologii ALS. Niniejsze badanie ma na celu dokonanie tego w oparciu o hipotezę, że ALS jest częściowo lub całkowicie spowodowany aktywacją dopełniacza.

Układ dopełniacza jest złożonym układem składającym się z białek w osoczu oraz białek związanych z błoną, które razem uzupełniają układ odpornościowy oparty na przeciwciałach. Układ dopełniacza jest samonapędzającym się systemem kaskadowym, który jest aktywowany różnymi drogami. Działa na zasadzie opsonizacji, w której białka dopełniacza wiążą się z mikroorganizmami, aktywując i celując w granulocyty, monocyty i makrofagi. Układ dopełniacza powoduje również cytolizę mikroorganizmów poprzez MAC (błonowy kompleks atakujący) poprzez aktywację komórek tucznych. Ponadto inaktywuje i likwiduje wypalone kompleksy immunologiczne oraz przeprowadza odbudowę apoptotyczną.

Niedawne badanie pilotażowe Neuromyelitis Optica wykazało, że układ dopełniacza odgrywa centralną rolę w patogenezie choroby, która wcześniej była błędnie postrzegana jako wczesne stadium stwardnienia rozsianego. Odkrycia te zaowocowały leczeniem antydopełniaczem (equlizumabem) z obiecującymi wynikami (8). Możliwe, że podobne mechanizmy patogenetyczne mogą leżeć u podłoża molekularnego ALS.

Różne grupy badawcze próbowały wyjaśnić, w jaki sposób układ odpornościowy jest zaangażowany w postęp ALS (9-35). Kilka badań potwierdza hipotezę, że układ dopełniacza ma kluczowe znaczenie dla wystąpienia i progresji ALS. (9-28)

W kilku badaniach klinicznych z osoczem ALS stwierdzono, że osocze ALS jest cytotoksyczne, gdy jest inkubowane ze zdrowymi krwinkami czerwonymi lub zdrową tkanką nerwową. Niektóre badania wskazują, że za cytotoksyczność odpowiada układ dopełniacza. Wyniki nie mogą jednak zostać powtórzone konsekwentnie we wszystkich badaniach klinicznych. Próby te przeprowadzono dziesiątki lat temu, kiedy metody wykrywania aktywności dopełniacza były ograniczone. (9-14)

Kilka badań na zwierzętach wskazuje, że ALS zaczyna się w połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) i dlatego powinno być uważane za dystalną aksonopatię, a nie ośrodkową chorobę neurologiczną, co obecnie jest powszechnym postrzeganiem ALS. (27-31)

Cel projektu Celem projektu jest poszerzenie wiedzy na temat patofizjologii choroby ALS, co być może przybliży nas do ukierunkowanego leczenia.

Grupa projektowa chce zbadać, czy można odzyskać wcześniej odkrytą, unikalną cytotoksyczność w osoczu ALS (9-14). Jeśli tak jest, to dzisiejsze nowoczesne metody pozwalają wykryć, czy układ odpornościowy w ogóle, aw szczególności układ dopełniacza, powoduje tę cytotoksyczność.

Stworzenie ogólnopolskiego projektu badawczego dotyczącego ALS i układu dopełniacza poprzez utworzenie biobanku badawczego z systematycznie pobieraną krwią i płynem rdzeniowym od pacjentów z SLA z całego kraju zapewni możliwość sprawdzenia, czy układ dopełniacza odgrywa rolę w zachorowaniu i progresji ALS.

Ponadto zostanie przeprowadzone badanie pilotażowe w celu zbadania, czy występuje aktywność dopełniacza w NMJ u pacjentów z ALS, jak wykazano w badaniu na myszach z ALS. (28)

hipotezy

1. ALS charakteryzuje się nieprawidłową odpowiedzią immunologiczną z cytotoksycznością i zwiększoną aktywnością dopełniacza w osoczu, co objawia się następującymi objawami:

   1. Osocze od pacjentów z ALS wykazuje zwiększoną aktywność hemolityczną po inkubacji z krwinkami czerwonymi od zdrowych osób.
   2. Aktywność dopełniacza jest zwiększona w osoczu pacjentów z ALS w porównaniu z osoczem pacjentów zdrowych neurologicznie i pacjentów z innymi chorobami neurologicznymi.
   3. Aktywność hemolityczna w osoczu pacjentów z ALS jest skorelowana z aktywnością dopełniacza.
2. Płyn rdzeniowy od pacjentów z ALS zawiera zwiększoną aktywność dopełniacza w porównaniu z płynem rdzeniowym od osób zdrowych neurologicznie i od osób z innymi chorobami neurologicznymi.

Pacjenci, materiały i metody:

Badanie kliniczne 1 (CT1): Aktywność hemolityczna i układ dopełniacza w osoczu ALS

Liczba badanych: 25 pacjentów z ALS, 25 pacjentów z innymi chorobami neurologicznymi, 25 zdrowych ochotników

Przebieg CT1: Od każdego pacjenta pobierana jest próbka krwi. Czerwone krwinki i płynna część krwi, osocze, są oddzielone. Czerwone krwinki od różnych osobników inkubuje się w osoczu innych osobników. Ten sam cykl próbny powtarza się po inaktywacji obecnego układu dopełniacza zarówno przez ciepło, jak i anty-dopełniacz.

Badanie kliniczne 2 (CT2): Badanie kliniczno-kontrolne mające na celu zmapowanie układu dopełniacza

Liczba badanych: 100 pacjentów z ALS, 100 pacjentów z innymi chorobami neurologicznymi i 100 pacjentów neurologicznie zdrowych

Przebieg CT2: Próbki krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego są przygotowywane, a następnie zamrażane w biobanku badawczym. Następnie próbki z 3 grup badanych są analizowane i porównywane, skupiając się na układzie dopełniacza: Potencjał aktywacji dopełniacza jest mierzony w materiale biologicznym. Tworzony jest profil cytokin, a także mapowane reagenty ostrej fazy za pomocą testów multipleksowych. Ponadto profil ekspresji RNA sporządza się na osadzie komórkowym stabilizowanym później RNA.

Badanie kliniczne 3 (CT3): Układ dopełniacza pacjentów z ALS w czasie — badanie kohortowe Liczba badanych: 20 pacjentów z ALS (podgrupa z CT2)

Przebieg CT3: Co 6 miesięcy powtarza się kurs z CT2. Aktywność układu dopełniacza u każdego pacjenta z ALS jest analizowana w miarę postępu choroby.

Badanie kliniczne 4 (CT4): Poszukiwanie aktywności dopełniacza w NMJ pacjentów z ALS

Liczba badanych: 10 pacjentów z ALS

Przebieg CT4: Biopsje mięśni są pobierane i natychmiast dostarczane do Dep. Patologii w Rigshospitalet. Następnie barwione są cienkie warstwy tkanki w celu analizy włókien mięśniowych i NMJ oraz wykrycia obecności aktywności dopełniacza.

Przeprowadzenie badania Projekt składa się z czterech badań klinicznych. Włączenie pacjentów odbywa się wspólnie z personelem przychodni ALS w szpitalach na terenie całego kraju, a pacjentów do grup kontrolnych włącza się zgodnie z poniższą listą miejsc włączenia.

Witryny włączenia:

Przychodnia ALS, Klinika neurologiczna, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Kontakt: Główny lekarz Elisabeth Elmo Klinika neurologiczna, Rigshospitalet Glostrup (neurologiczna grupa kontrolna, CT1+2) Kontakt: Profesor, Główny lekarz, dr.med. Rigmor Højland Jensen Klinika Neurochirurgii, Rigshospitalet (grupa kontrolna neurologiczna, CT2) Kontakt: Profesor, lekarz naczelny, dr.med. Marianne Juhler Przychodnia ALS, Oddział Neurologiczny, Szpital Bispebjerg (CT2) Kontakt: Główny lekarz Merete Karlsborg Przychodnia ALS, Oddział Neurologiczny, Szpital Roskilde (CT2 + 3) Kontakt: Główny lekarz Przychodnia Helle Tagesen ALS, Oddział Neurologiczny, Szpital Uniwersytecki w Odense (CT2) Kontakt: Główny lekarz, dr.med. Matthias Bode Przychodnia ALS, Oddział Neurologiczny, Szpital Aarhus, Nørrebrogade (Badanie Kliniczne 2) Kontakt: Główny Lekarz, dr. Anette Torvin Gildhøj Private Hospital, Brøndby (grupa kontrolna zdrowych neurologicznie, badanie kliniczne 2) Kontakt: anestezjolog Niels Anker Pedersen

Obliczenia mocy CT1: Aktywność hemolityczna i układ dopełniacza w osoczu ALS Badanie Overgaard et al. (18) stwierdzili średnią różnicę około 0,20 (SE 0,052 w grupie ALS, N=20, SD 0,22) w absorbancji (415 nm i 5 godzin inkubacji) pomiędzy pacjentami z ALS a zdrowymi bioanalitykami. Przy α=0,05 i beta=0,20 odpowiadającym potędze 0,80 musimy uwzględnić 21 podmiotów. Jako możliwe wypadki i technicznie nieudane testy są uważane za testy, badacze wybierają włączenie 25 osób do każdej grupy. (36)

CT2: Badanie kliniczno-kontrolne mapujące układ dopełniacza Liczba osobników w każdej grupie jest w tym badaniu kliniczno-kontrolnym obliczona na podstawie współczynnika α=0,05. Badacze porównują potencjał aktywacji dopełniacza w 3 grupach z taką samą liczbą osobników w każdej. U zdrowych ochotników potencjał aktywacji dopełniacza wynosi 100% z prawidłowym obszarem w zakresie 50-150%, a częstość występowania niskiego potencjału aktywacji dopełniacza (poniżej 50%) wynosi poniżej 10%. Przy potędze =0,80 obliczono, że w każdej grupie należy uwzględnić 100 osób. W ten sposób możliwe jest znalezienie statystycznie istotnych różnic między grupami odpowiadających ilorazowi szans 2,3, co odpowiadałoby 20% pacjentów z ALS o niskim potencjale aktywacji dopełniacza spowodowanym zwiększoną aktywnością dopełniacza. (36)

CT3: Układ dopełniacza pacjentów z ALS w czasie – badanie kohortowe To jest badanie generujące hipotezę. Oczekuje się, że 20 pacjentów z ALS włączonych do tej kohorty będzie stanowić podgrupę z Badania Klinicznego 2. Jako wyjściową grupę kontrolną wykorzystana zostanie neurologicznie zdrowa grupa kontrolna z Badania Klinicznego 2.

CT4: Poszukiwanie aktywności dopełniacza w NMJ pacjentów z ALS Nie ma wcześniejszych badań opisujących aktywność dopełniacza w NMJ u żywych ludzi. Nie ma zatem potrzeby obliczania mocy.

Przetwarzanie danych CT1: Aktywność hemolityczna i układ dopełniacza w osoczu ALS Porównanie stopnia hemolizy między pacjentami z ALS a grupami kontrolnymi Stosowany jest test t i jednokierunkowa analiza ANOVA. Do obliczenia wartości odcięcia badacze wykorzystują krzywe charakterystyki działania odbiornika (ROC).

CT2: Badanie kliniczno-kontrolne mapujące układ dopełniacza Porównanie stężenia dopełniacza i potencjału aktywacji dopełniacza między pacjentami z ALS a grupami kontrolnymi t-test i jednokierunkowa ANOVA są stosowane. W celu obliczenia prawdopodobieństwa niskiego potencjału aktywacji dopełniacza w grupie ALS w porównaniu z grupami kontrolnymi badacze stosują regresję logistyczną. Do obliczenia wartości odcięcia wykorzystuje się krzywe charakterystyki pracy odbiornika (ROC).

CT3: Układ dopełniacza pacjentów z ALS w czasie — badanie kohortowe Jak w badaniu klinicznym 2. Ponadto analiza regresji aktywności dopełniacza w funkcji czasu od wystąpienia ALS, płci, wieku, podtypu choroby i postępu choroby prowadzone.

CT4: Poszukiwanie aktywności dopełniacza w NMJ pacjentów z ALS Jak w CT2. Stopień złogów dopełniacza i patologii mięśni opisano jakościowo i przeprowadzono zaślepioną ocenę zmian „normalnych”, „lekkich” i „ciężkich”. Zostanie to porównane ilościowo z tabelami 2 x K i statystykami nieparametrycznymi.

Rozpowszechnianie wyników Wyniki projektu zostaną opublikowane w międzynarodowych recenzowanych czasopismach. Publikowane będą zarówno pozytywne, jak i negatywne wyniki.

Perspektywa Wraz z utworzeniem dużego krajowego biobanku badawczego ALS możliwe będzie prowadzenie wielu przyszłych projektów badawczych. Ciągłe badania nad ALS mają ogromne znaczenie dla pacjentów z ALS w kraju i za granicą, aby zachować nadzieję na skuteczne leczenie tej agresywnej choroby w przyszłości.