Esclerose Lateral Amiotrófica e o Sistema Imune Inato

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva e mortal que afeta os neurônios motores superiores e inferiores. Isso leva a distrofia muscular profunda, hiperreflexia, fasciculações e paresia da musculatura bulbar e esquelética. A ELA causa fadiga física crescente e os pacientes logo ficam acamados e com insuficiência respiratória. O diagnóstico de ELA é feito de acordo com o El Escorial revisitado. Frequentemente testes clínicos e neurofisiológicos devem ser repetidos (1-4).

Na Dinamarca, a incidência de ELA é de 1-2/100.000 e a prevalência é de 4-6/100.000. O tempo médio de sobrevida desde o momento do diagnóstico é de 3 anos, mas com grande variação. (5+6)

Hoje a patogênese ainda é desconhecida e nenhum tratamento pode parar a progressão da ELA. O tratamento com riluzole parece prolongar o tempo médio de sobrevida para 2 ou 3 meses (7).

Muito provavelmente, um futuro tratamento médico requer uma melhor compreensão da patogênese, bem como da fisiopatologia da ELA. O presente estudo visa fazê-lo com base na hipótese de que a ELA é parcial ou totalmente causada pela ativação do complemento.

O sistema complemento é um sistema complexo que consiste em proteínas no plasma, bem como proteínas ligadas à membrana que, juntas, complementam o sistema imunológico baseado em anticorpos. O sistema complemento é um sistema em cascata que se autoperpetua e é ativado por diferentes vias. Ele funciona por opsonização onde as proteínas do complemento se ligam aos microorganismos para ativar e direcionar granulócitos, monócitos e macrófagos. O sistema complemento também causa citólise de microorganismos via MAC (complexo de ataque à membrana) por ativação dos mastócitos. Também inativa e elimina complexos imunes esgotados, além de realizar renovação apoptótica.

Um estudo piloto recente da Neuromielite Óptica mostrou como o sistema complemento desempenha um papel central na patogênese de uma doença que anteriormente era erroneamente percebida como um estágio inicial da Esclerose Disseminada. Esses achados resultaram em tratamento médico com anticomplemento (equlizumab) com resultados promissores (8). É possível que mecanismos patogenéticos semelhantes possam ser a base molecular da ELA.

Diferentes grupos de pesquisa tentaram esclarecer como o sistema imunológico está envolvido na progressão da ELA (9-35). Vários estudos suportam a hipótese de que o sistema complemento é de importância crucial para o aparecimento e progressão da ELA. (9-28)

Em vários ensaios clínicos com plasma ALS concluiu-se que o plasma ALS é citotóxico quando incubado com glóbulos vermelhos saudáveis ​​ou tecido nervoso saudável. Algumas pesquisas indicam que a citotoxicidade é causada pelo sistema complemento. Os resultados não podem, no entanto, ser reproduzidos consequentemente em todos os ensaios clínicos. Esses ensaios foram conduzidos décadas atrás, onde os métodos de detecção da atividade do complemento eram limitados. (9-14)

Vários ensaios em animais indicam que a ELA começa nas junções neuromusculares (NMJ) e, portanto, deve ser considerada uma axonopatia distal e não uma doença neurológica central, que hoje é a percepção geral da ELA. (27-31)

O objetivo do projeto O objetivo é aumentar o conhecimento da fisiopatologia da doença ELA, pois isso possivelmente pode nos aproximar de um tratamento médico direcionado.

O grupo do projeto deseja investigar se uma citotoxicidade única encontrada anteriormente no plasma da ELA pode ser recuperada (9-14). Se for esse o caso, os métodos modernos de hoje permitem detectar se o sistema imunológico em geral, e em particular o sistema complemento, está causando essa citotoxicidade.

O estabelecimento de um projeto de pesquisa nacional sobre ELA e o sistema complemento, criando um biobanco de pesquisa com sangue e líquido cefalorraquidiano coletados sistematicamente de pacientes com ELA de todo o país, garantirá a oportunidade de descobrir se o sistema complemento desempenha um papel no início e progressão da ELA.

Além disso, um estudo piloto será conduzido com o objetivo de investigar se há atividade do complemento na JNM em pacientes com ELA, conforme demonstrado em um estudo com camundongos ELA. (28)

as hipóteses

1. ALS é caracterizada por uma resposta imune anormal com citotoxicidade e aumento da atividade do complemento no plasma, que é revelada pelo seguinte:

   1. O plasma de pacientes com ELA mostra atividade hemolítica aumentada quando incubado com glóbulos vermelhos de indivíduos saudáveis.
   2. A atividade do complemento é aumentada no plasma de pacientes com ELA em comparação com o plasma de indivíduos neurologicamente saudáveis ​​e indivíduos com outras doenças neurológicas.
   3. A atividade hemolítica no plasma de pacientes com ELA está correlacionada com a atividade do complemento.
2. O líquido espinhal de pacientes com ELA contém aumento da atividade do complemento em comparação com o líquido espinhal de indivíduos neurologicamente saudáveis ​​e de indivíduos com outras doenças neurológicas.

Pacientes, materiais e métodos:

Ensaio clínico 1(CT1): Atividade hemolítica e o sistema complemento no plasma da ELA

Número de indivíduos: 25 pacientes com ELA, 25 pacientes com outras doenças neurológicas, 25 voluntários saudáveis

O curso de CT1: Uma amostra de sangue é retirada de cada paciente. Os glóbulos vermelhos e a parte líquida do sangue, o plasma, são separados. Os glóbulos vermelhos de diferentes indivíduos são incubados no plasma de um outro indivíduo. O mesmo curso de teste é repetido após a inativação do presente sistema complemento tanto por calor quanto por anti-complemento.

Ensaio clínico 2(CT2): Estudo de caso-controle com o objetivo de mapear o sistema complemento

Número de indivíduos: 100 pacientes com ELA, 100 pacientes com outras doenças neurológicas e 100 pacientes neurologicamente saudáveis

O curso de CT2: Amostras de sangue e líquido cefalorraquidiano são preparadas e depois congeladas em um biobanco de pesquisa. Em seguida, as amostras dos 3 grupos de sujeitos são analisadas e comparadas com foco no sistema complemento: O potencial de ativação do complemento é medido no material biológico. Um perfil de citocinas é feito, bem como o mapeamento dos reagentes de fase aguda por ensaios multiplex. Além disso, o perfil de expressão de RNA é feito em um pellet celular estabilizado com RNA posteriormente.

Ensaio clínico 3 (CT3): O sistema de complemento de pacientes com ELA ao longo do tempo - um estudo de coorte Número de indivíduos: 20 pacientes com ELA (subconjunto de CT2)

O curso do CT3: A cada seis meses é repetido o curso do CT2. A atividade do sistema complemento em cada paciente com ELA é analisada à medida que a doença progride.

Ensaio clínico 4(CT4): Pesquisa de atividade do complemento na JNM de pacientes com ELA

Número de indivíduos: 10 pacientes com ELA

O curso de CT4: As biópsias musculares são feitas e imediatamente trazidas para o Dep. de Patologia do Rigshospitalet. Em seguida, camadas finas de tecido são coradas para analisar as fibras musculares e o NMJ, bem como detectar a presença de atividade do complemento.

Realização do estudo O projeto consiste em quatro ensaios clínicos. A inclusão dos sujeitos é feita em conjunto com a equipe nos ambulatórios de ELA em hospitais de todo o país e os sujeitos dos grupos de controle são incluídos de acordo com a lista de locais de inclusão abaixo.

Locais de inclusão:

Ambulatório de ELA, Clínica Neurológica, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Contato: Médico-chefe Elisabeth Elmo Clínica Neurológica, Rigshospitalet Glostrup (grupo de controle neurológico, CT1+2) Contato: Professor, Médico-chefe, dr.med. Clínica Neurocirúrgica Rigmor Højland Jensen, Rigshospitalet (grupo de controle neurológico, CT2) Contato: Professor, médico chefe, dr.med. Marianne Juhler Ambulatório de ALS, Dep. Neurológico, Hospital Bispebjerg (CT2) Contato: Médico-chefe Merete Karlsborg Ambulatório de ALS, Dep. Neurológico, Hospital Roskilde (CT2 + 3) Contato: Médico-chefe Helle Thagesen Ambulatório de ALS, Dep. Neurológico, Hospital Universitário de Odense (CT2) Contato: Médico-chefe, dr.med. Clínica ambulatorial Matthias Bode ALS, Neurological Dep., Aarhus Hospital, Nørrebrogade (Ensaio clínico 2) Contato: Médico-chefe, Ph.d. Anette Torvin Gildhøj Private Hospital, Brøndby (Grupo de controle neurologicamente saudável, Ensaio Clínico 2) Contato: Anestesiologista Niels Anker Pedersen

Cálculos de potência CT1: Atividade hemolítica e o sistema complemento no plasma da ELA O estudo Overgaard et al. (18) encontraram uma diferença média de cerca de 0,20 (SE 0,052 no grupo ELA, N=20, DP 0,22) na absorbância (415 nm e 5 horas de incubação) entre pacientes com ELA e bioanalistas saudáveis. Com α=0,05 og beta=0,20 correspondendo à potência 0,80 precisamos incluir 21 sujeitos. Como possíveis desistências e falhas técnicas são considerados testes, os investigadores optam por incluir 25 indivíduos em cada grupo. (36)

CT2: Estudo de caso-controle mapeando o sistema complemento O número de indivíduos em cada grupo é calculado neste estudo de caso-controle com α=0,05. Os investigadores comparam o potencial de ativação do complemento de 3 grupos com a mesma quantidade de indivíduos em cada um. Em indivíduos saudáveis, o potencial de ativação do complemento é de 100% com uma área normal variando de 50-150% e onde a prevalência de baixo potencial de ativação do complemento (abaixo de 50%) é inferior a 10%. Com poder =0,80 calcula-se que seja necessário incluir 100 sujeitos em cada grupo. Com isso é possível encontrar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos correspondendo a um odds ratio de 2,3, o que corresponderia a 20% dos pacientes com ELA apresentando baixo potencial de ativação do complemento causado pelo aumento da atividade do complemento. (36)

CT3: O sistema de complemento de pacientes com ELA ao longo do tempo - um estudo de coorte Este é um estudo gerador de hipóteses. Espera-se que os 20 pacientes com ELA incluídos nesta coorte sejam um subconjunto do Ensaio Clínico 2. Como grupo de controle na linha de base, o grupo de controle neurologicamente saudável do Ensaio Clínico 2 será usado.

CT4: Pesquisando a atividade do complemento na JNM de pacientes com ELA Não há estudos anteriores descrevendo a atividade do complemento na JNM em seres humanos vivos. Portanto, não é relevante fazer um cálculo de potência.

Processamento de dados CT1: Atividade hemolítica e o sistema complemento no plasma ALS Comparando o grau de hemólise entre os pacientes ALS e os grupos de controle teste t e ANOVA de uma via são usados. Para calcular os valores de corte, os investigadores usam curvas de característica de operação do receptor (ROC).

CT2: Estudo de caso-controle mapeando o sistema complemento Comparando a concentração de complemento e o potencial de ativação do complemento entre pacientes com ELA e os grupos controle, são usados ​​o teste t e ANOVA de uma via. A fim de calcular as chances de baixo potencial de ativação do complemento no grupo ALS em comparação com os grupos de controle, os investigadores usam a regressão logística. Para calcular os valores de corte são usadas as curvas ROC (Receive Operating Characteristic).

CT3: O sistema de complemento de pacientes com ELA ao longo do tempo - um estudo de coorte Como no Ensaio Clínico 2. Além disso, a análise de regressão da atividade do complemento em função do tempo desde o início da ELA, sexo, idade, subtipo de doença e progressão da doença são conduzido.

CT4: Pesquisa de atividade do complemento na JNM de pacientes com ELA Como em CT2. O grau de deposição de complemento e patologia muscular é descrito qualitativamente e uma pontuação cega em "normal", "grau leve" e "grau grave" de alterações é realizada. Isso será comparado quantitativamente com tabelas 2 x K e estatísticas não paramétricas.

Divulgação dos resultados Os resultados do projeto serão publicados em periódicos internacionais revisados ​​por pares. Resultados positivos e negativos serão publicados.

Perspectiva Com o estabelecimento de um grande biobanco nacional de pesquisa de ELA, será possível conduzir muitos projetos de pesquisa futuros. A pesquisa contínua em ELA é fundamental para pacientes com ELA, tanto nacional quanto internacionalmente, a fim de manter a esperança de que um tratamento médico eficiente para esta doença agressiva seja encontrado no futuro.