Amyotrofisk lateral sklerose og det medfødte immunsystemet

Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en progressiv, dødelig, nevrodegenerativ sykdom som påvirker de øvre og nedre motoriske nevronene. Dette fører til dyp muskeldystrofi, hyperrefleksi, fascikulasjoner og pareser i bulbaren samt skjelettmuskulaturen. ALS forårsaker økende fysisk tretthet og pasientene blir snart sengeliggende og respiratoriske utilstrekkelige. Diagnosen ALS stilles i henhold til El Escorial revisited. Ofte må kliniske og nevrofysiologiske tester gjentas (1-4).

I Danmark er forekomsten av ALS 1-2/100.000 og prevalensen er 4-6/100.000. Gjennomsnittlig overlevelsestid fra diagnosetidspunktet er 3 år, men med stor variasjon. (5+6)

I dag er patogenesen fortsatt ukjent og ingen behandling kan stoppe utviklingen av ALS. Behandling med riluzol ser ut til å forlenge median overlevelsestid i 2 eller 3 måneder (7).

Mest sannsynlig krever en fremtidig medisinsk behandling en bedre forståelse av patogenesen så vel som patofysiologien til ALS. Denne nåværende studien tar sikte på å gjøre det basert på hypotesen om at ALS delvis eller fullstendig er forårsaket av komplementaktivering.

Komplementsystemet er et komplekst system som består av proteiner i plasma samt membranbundne proteiner som sammen komplementerer det antistoffbaserte immunsystemet. Komplementsystemet er et selvforevigende kaskadesystem som aktiveres gjennom forskjellige veier. Det fungerer ved opsonisering der komplementproteiner binder seg til mikroorganismer for å aktivere og målrette granulocytter, monocytter og makrofager. Komplementsystemet forårsaker også cytolyse av mikroorganismer via MAC (membranangrepskompleks) ved aktivering av mastcellene. Den inaktiverer og eliminerer også utbrente immunkomplekser, samt utfører apoptotisk renovering.

En fersk pilotstudie av Neuromyeitis Optica har vist hvordan komplementsystemet spiller en sentral rolle i patogenesen av en sykdom som tidligere feilaktig ble oppfattet som et tidlig stadium av disseminert sklerose. Disse funnene resulterte i medisinsk behandling med antikomplement (equlizumab) med lovende resultater (8). Det er mulig at lignende patogenetiske mekanismer kan være det molekylære grunnlaget for ALS.

Ulike forskningsgrupper har forsøkt å belyse hvordan immunsystemet er involvert i utviklingen av ALS (9-35). Flere studier støtter hypotesen om at komplementsystemet er av avgjørende betydning for utbruddet og progresjonen av ALS. (9-28)

I flere kliniske studier med ALS-plasma er det konkludert med at ALS-plasma er cytotoksisk når det inkuberes med friske røde blodlegemer eller sunt nervevev. Noe forskning indikerer at cytotoksisiteten er forårsaket av komplementsystemet. Resultatene kan imidlertid ikke reproduseres i alle kliniske studier. Disse forsøkene ble utført for flere tiår siden hvor metodene for å oppdage komplementaktivitet var begrenset. (9-14)

Flere dyreforsøk indikerer at ALS starter i de nevromuskulære knutepunktene (NMJ) og derfor bør betraktes som en distal aksonopati snarere enn en sentral nevrologisk sykdom, som i dag er den generelle oppfatningen av ALS. (27-31)

Formålet med prosjektet Målet er å øke kunnskapen om patofysiologien til sykdommen ALS da dette muligens kan føre oss nærmere en målrettet medisinsk behandling.

Prosjektgruppen ønsker å undersøke om en tidligere funnet, unik cytotoksisitet i ALS-plasmaet kan gjenfinnes (9-14). Hvis dette er tilfelle, så gjør dagens moderne metoder det mulig å oppdage om immunsystemet generelt, og spesielt komplementsystemet, forårsaker denne cytotoksisiteten.

Etablering av et nasjonalt forskningsprosjekt om ALS og komplementsystemet ved å lage en forskningsbiobank med systematisk innsamlet blod og ryggmargsvæske fra ALS-pasienter fra hele landet skal sikre muligheten til å finne ut om komplementsystemet spiller en rolle i oppstarten. og progresjon av ALS.

Videre vil det bli gjennomført en pilotstudie med det formål å undersøke om det er komplementaktivitet i NMJ hos pasienter med ALS slik det er vist i en studie med ALS-mus. (28)

Hypotesene

1. ALS er preget av en unormal immunrespons med cytotoksisitet og økt komplementaktivitet i plasma som avsløres av følgende:

   1. Plasma fra pasienter med ALS viser økt hemolytisk aktivitet når inkubert med røde blodlegemer fra friske personer.
   2. Komplementaktiviteten er økt i plasma fra ALS-pasienter sammenlignet med plasma fra nevrologisk friske personer og personer med annen nevrologisk sykdom.
   3. Den hemolytiske aktiviteten i plasma fra ALS-pasienter er korrelert med komplementaktiviteten.
2. Spinalvæske fra ALS-pasienter inneholder økt komplementaktivitet sammenlignet med spinalvæske fra nevrologisk friske forsøkspersoner og fra forsøkspersoner med annen nevrologisk sykdom.

Pasienter, materialer og metoder:

Klinisk studie 1(CT1): Hemolytisk aktivitet og komplementsystemet i ALS-plasma

Antall forsøkspersoner: 25 pasienter med ALS, 25 pasienter med annen nevrologisk sykdom, 25 friske frivillige

Forløpet av CT1: Det tas en blodprøve fra hver pasient. De røde blodcellene og den flytende delen av blodet, plasmaet, separeres. De røde blodcellene fra forskjellige individer inkuberes i en annen pasients plasma. Det samme prøveforløpet gjentas etter inaktivering av det nåværende komplementsystemet både ved varme og ved anti-komplement.

Klinisk studie 2(CT2): Kasuskontrollstudie med sikte på å kartlegge komplementsystemet

Antall forsøkspersoner: 100 pasienter med ALS, 100 pasienter med annen nevrologisk sykdom og 100 nevrologisk friske pasienter

Forløpet av CT2: Blodprøver og cerebrospinalvæske forberedes og fryses deretter ned i en forskningsbiobank. Deretter blir prøvene fra de 3 gruppene av forsøkspersoner analysert og sammenlignet med fokus på komplementsystemet: Komplementaktiveringspotensialet måles i det biologiske materialet. En cytokinprofil lages i tillegg til å kartlegge akuttfasereaktantene ved multipleksanalyser. Videre er RNA-ekspresjonsprofilen laget på en cellepellet stabilisert med RNA senere.

Klinisk studie 3(CT3): Komplementsystemet til ALS-pasienter over tid - en kohortstudie Antall forsøkspersoner:20 pasienter med ALS (undergruppe fra CT2)

Forløpet til CT3: Hver sjette måned gjentas kurset fra CT2. Aktiviteten til komplementsystemet hos hver pasient med ALS analyseres etter hvert som sykdommen utvikler seg.

Klinisk studie 4(CT4): Søker etter komplementaktivitet i NMJ hos ALS-pasienter

Antall forsøkspersoner:10 pasienter med ALS

Forløpet av CT4: Muskelbiopsiene tas og bringes umiddelbart til avd. i patologi ved Rigshospitalet. Deretter farges tynne lag med vev for å analysere muskelfibrene og NMJ samt oppdage tilstedeværelse av komplementaktivitet.

Gjennomføring av studien Prosjektet består av fire kliniske studier. Inkludering av forsøkspersonene gjøres sammen med ansatte i ALS-poliklinikker ved sykehus over hele landet og forsøkspersoner for kontrollgruppene er inkludert i henhold til listen over inklusjonssteder nedenfor.

Inkluderingsnettsteder:

ALS-poliklinikk, Nevrologisk klinikk, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Kontakt: Overlege Elisabeth Elmo Nevrologiske klinikk, Rigshospitalet Glostrup (nevrologisk kontrollgruppe, CT1+2) Kontakt: Professor, overlege, dr.med. Rigmor Højland Jensen Nevrokirurgisk klinikk, Rigshospitalet (nevrologisk kontrollgruppe, CT2) Kontakt: Professor, overlege, dr.med. Marianne Juhler ALS-poliklinikk, Nevrologisk avd., Bispebjerg Hospital (CT2) Kontakt: Overlege Merete Karlsborg ALS-poliklinikk, Nevrologisk avd., Roskilde Sykehus (CT2 + 3) Kontakt: Overlege Helle Thagesen ALS-poliklinikk, Nevrologisk avd. Odense Universitetssykehus (CT2) Kontakt: Overlege, dr.med. Matthias Bode ALS poliklinikk, Nevrologisk Avd., Århus Sykehus, Nørrebrogade (Klinisk Forsøk 2) Kontakt: Overlege, ph.d. Anette Torvin Gildhøj Privatsykehus, Brøndby (Neurologisk frisk kontrollgruppe, Clinical Trial 2) Kontakt: Anestesilege Niels Anker Pedersen

Effektberegninger CT1: Hemolytisk aktivitet og komplementsystemet i ALS-plasma Studien Overgaard et al. (18) fant en gjennomsnittlig forskjell på ca. 0,20 (SE 0,052 i ALS-gruppen, N=20, SD 0,22) i absorbansen (415 nm og 5 timers inkubasjon) mellom ALS-pasienter og friske bioanalytikere. Med α=0,05 og beta=0,20 tilsvarende potens 0,80 må vi inkludere 21 emner. Som mulige frafall og teknisk mislykkede regnes tester som etterforskerne velger å inkludere 25 forsøkspersoner i hver gruppe. (36)

CT2: Kasuskontrollstudie som kartlegger komplementsystemet Antall forsøkspersoner i hver gruppe er i denne case-kontrollstudien beregnet med α=0,05. Forskerne sammenligner komplementaktiveringspotensialet til 3 grupper med samme mengde individer i hver. Hos friske personer er komplementaktiveringspotensialet 100 % med et normalt område som varierer fra 50-150 % og hvor prevalensen av lavt komplementaktiveringspotensial (under 50 %) er under 10 %. Med kraft =0,80 er det beregnet å være nødvendig å inkludere 100 emner i hver gruppe. Herved er det mulig å finne statistisk signifikante forskjeller mellom gruppene tilsvarende en oddsratio på 2,3, som vil tilsvare at 20 % av ALS-pasienter har et lavt komplementaktiveringspotensial forårsaket av økt komplementaktivitet. (36)

CT3: Komplementsystemet til ALS-pasienter over tid - en kohortstudie Dette er en hypotesegenererende studie. Det forventes at de inkluderte 20 ALS-pasientene i denne kohorten vil være en undergruppe fra Clinical Trial 2. Som kontrollgruppe ved baseline vil den nevrologisk friske kontrollgruppen fra Clinical Trial 2 bli brukt.

CT4: Søke etter komplementaktivitet i NMJ hos ALS-pasienter Det er ingen tidligere studier som beskriver komplementaktiviteten i NMJ hos levende mennesker. Det er derfor ikke aktuelt å gjøre en effektberegning.

Databehandling CT1: Hemolytisk aktivitet og komplementsystemet i ALS-plasma Sammenligning av hemolysegrad mellom ALS-pasientene og kontrollgruppene brukes t-test og enveis ANOVA. For å beregne grenseverdiene bruker etterforskerne mottakeroperasjonskarakteristikk (ROC) kurver.

CT2: Kasuskontrollstudie kartlegging av komplementsystemet Sammenligning av konsentrasjonen av komplement og komplementaktiveringspotensialet mellom ALS-pasienter og kontrollgruppene t-test og enveis ANOVA brukes. For å beregne oddsen for lavt komplementaktiveringspotensial i ALS-gruppen sammenlignet med kontrollgruppene bruker etterforskerne logistisk regresjon. For å beregne grenseverdiene brukes mottakerdriftskarakteristikk (ROC) kurver.

CT3: ALS-pasienters komplementsystem over tid - en kohortstudie Som i Clinical Trial 2. Videre er regresjonsanalyse av komplementaktiviteten som funksjon av tid siden oppstart av ALS, kjønn, alder, undertype av sykdom og sykdomsprogresjon. gjennomført.

CT4: Søker etter komplementaktivitet i NMJ av ALS-pasienter Som i CT2. Graden av komplementavsetning og muskelpatologi beskrives kvalitativt og det gjennomføres en blindet skåring i "normal", "lett grad" og "alvorlig grad" av endringer. Dette vil bli sammenlignet kvantitativt med 2 x K-tabeller og ikke-parametrisk statistikk.

Formidling av resultater Resultatene fra prosjektet vil bli publisert i internasjonale fagfellevurderte tidsskrifter. Både positive og negative funn vil bli publisert.

Perspektivering Med etableringen av en stor nasjonal ALS forskningsbiobank vil det være mulig å gjennomføre mange fremtidige forskningsprosjekter. Kontinuerlig forskning på ALS er avgjørende for ALS-pasienter nasjonalt så vel som internasjonalt for å opprettholde håpet om en effektiv medisinsk behandling for denne aggressive sykdommen som finnes i fremtiden.