Amyotrofická laterální skleróza a vrozený imunitní systém

Amyotrofická laterální skleróza (ALS) je progresivní, smrtelné, neurodegenerativní onemocnění, které postihuje horní a dolní motorické neurony. To vede k hluboké svalové dystrofii, hyperreflexii, fascikulacím a parézám bulbárního i kosterního svalstva. ALS způsobuje zvyšující se fyzickou únavu a pacienti se brzy stávají upoutáni na lůžko a nedostatečně dýchají. Diagnóza ALS je stanovena podle El Escorial revisited. Často se musí opakovat klinické a neurofyziologické testy (1-4).

V Dánsku je výskyt ALS 1-2/100 000 a prevalence je 4-6/100 000. Průměrná doba přežití od stanovení diagnózy je 3 roky, ale s velkým rozptylem. (5+6)

Dnes je patogeneze stále neznámá a žádná léčba nemůže zastavit progresi ALS. Zdá se, že léčba riluzolem prodlužuje medián doby přežití na 2 nebo 3 měsíce [7].

Budoucí lékařská léčba s největší pravděpodobností vyžaduje lepší pochopení patogeneze i patofyziologie ALS. Cílem této studie je to udělat na základě hypotézy, že ALS je částečně nebo plně způsobena aktivací komplementu.

Systém komplementu je komplexní systém skládající se z proteinů v plazmě a také z proteinů vázaných na membránu, které společně doplňují imunitní systém založený na protilátkách. Systém komplementu je samočinně se zvěčňující kaskádový systém, který je aktivován různými cestami. Funguje opsonizací, kdy se komplementové proteiny vážou na mikroorganismy, aby aktivovaly a zacílily granulocyty, monocyty a makrofágy. Systém komplementu také způsobuje cytolýzu mikroorganismů prostřednictvím MAC (membrane attack complex) aktivací žírných buněk. Také inaktivuje a eliminuje vyhořelé imunitní komplexy a také provádí apoptotickou obnovu.

Nedávná pilotní studie Neuromyelitis Optica ukázala, jak komplementový systém hraje ústřední roli v patogenezi onemocnění, které bylo dříve mylně vnímáno jako rané stadium roztroušené sklerózy. Tyto nálezy vyústily v medikamentózní léčbu antikomplementem (ekulizumab) se slibnými výsledky (8). Je možné, že podobné patogenetické mechanismy by mohly být molekulárním základem ALS.

Různé výzkumné skupiny se pokusily objasnit, jak se imunitní systém podílí na progresi ALS (9-35). Několik studií podporuje hypotézu, že systém komplementu má zásadní význam pro vznik a progresi ALS. (9-28)

V několika klinických studiích s ALS plazmou se dospělo k závěru, že ALS plazma je cytotoxická, když je inkubována se zdravými červenými krvinkami nebo zdravou nervovou tkání. Některé výzkumy naznačují, že cytotoxicita je způsobena systémem komplementu. Výsledky však nelze následně reprodukovat ve všech klinických studiích. Tyto studie byly provedeny před desetiletími, kde byly metody detekce aktivity komplementu omezené. (9-14)

Několik pokusů na zvířatech ukazuje, že ALS začíná v neuromuskulárních spojeních (NMJ), a proto by měla být považována spíše za distální axonopatii než za centrální neurologické onemocnění, které je dnes obecně vnímáno jako ALS. (27-31)

Účel projektu Cílem projektu je rozšířit znalosti o patofyziologii onemocnění ALS, protože nás to může přivést blíže k cílené lékařské léčbě.

Projektová skupina chce prozkoumat, zda lze získat dříve zjištěnou jedinečnou cytotoxicitu v plazmě ALS (9-14). Pokud tomu tak je, pak dnešní moderní metody umožňují odhalit, zda imunitní systém obecně, a zejména systém komplementu, způsobuje tuto cytotoxicitu.

Založení národního výzkumného projektu o ALS a systému komplementu vytvořením výzkumné biobanky se systematicky odebranou krví a míšní tekutinou od pacientů s ALS z celé země zajistí příležitost zjistit, zda systém komplementu hraje roli při vzniku a progresi ALS.

Dále bude provedena pilotní studie s cílem prozkoumat, zda existuje aktivita komplementu v NMJ u pacientů s ALS, jak bylo prokázáno ve studii na myších ALS. (28)

Hypotézy

1. ALS je charakterizována abnormální imunitní odpovědí s cytotoxicitou a zvýšenou aktivitou komplementu v plazmě, která se projevuje následujícím:

   1. Plazma pacientů s ALS vykazuje zvýšenou hemolytickou aktivitu při inkubaci s červenými krvinkami od zdravých subjektů.
   2. Aktivita komplementu je zvýšena v plazmě od pacientů s ALS ve srovnání s plazmou od neurologicky zdravých subjektů a subjektů s jiným neurologickým onemocněním.
   3. Hemolytická aktivita v plazmě pacientů s ALS koreluje s aktivitou komplementu.
2. Míšní tekutina od pacientů s ALS obsahuje zvýšenou aktivitu komplementu ve srovnání s míšní tekutinou od neurologicky zdravých subjektů a od subjektů s jiným neurologickým onemocněním.

Pacienti, materiály a metody:

Klinická studie 1 (CT1): Hemolytická aktivita a systém komplementu v ALS plazmě

Počet subjektů: 25 pacientů s ALS, 25 pacientů s jiným neurologickým onemocněním, 25 zdravých dobrovolníků

Průběh CT1: Každému pacientovi je odebrán vzorek krve. Červené krvinky a tekutá část krve, plazma, jsou odděleny. Červené krvinky od různých subjektů jsou inkubovány v plazmě jiných subjektů. Stejný zkušební průběh se opakuje po inaktivaci přítomného komplementového systému jak teplem, tak antikomplementem.

Klinická studie 2 (CT2): Případově-kontrolní studie zaměřená na zmapování systému komplementu

Počet subjektů: 100 pacientů s ALS, 100 pacientů s jiným neurologickým onemocněním a 100 neurologicky zdravých pacientů

Průběh CT2: Vzorky krve a mozkomíšního moku jsou připraveny a následně zmraženy ve výzkumné biobance. Poté jsou vzorky od 3 skupin subjektů analyzovány a porovnávány se zaměřením na systém komplementu: V biologickém materiálu se měří potenciál aktivace komplementu. Je vytvořen cytokinový profil a také mapování reaktantů akutní fáze pomocí multiplexních testů. Kromě toho je profil exprese RNA vytvořen na buněčné peletě stabilizované RNA později.

Klinická studie 3 (CT3): Systém komplementu pacientů s ALS v průběhu času – kohortová studie Počet subjektů: 20 pacientů s ALS (podskupina z CT2)

Průběh CT3: Každý šestý měsíc se kurz z CT2 opakuje. Aktivita komplementového systému u každého pacienta s ALS se analyzuje s progresí onemocnění.

Klinická studie 4 (CT4): Hledání aktivity komplementu v NMJ pacientů s ALS

Počet subjektů: 10 pacientů s ALS

Průběh CT4: Svalové biopsie jsou odebrány a ihned přeneseny na kli. patologie v Rigshospitalet. Poté se obarví tenké vrstvy tkáně, aby se analyzovala svalová vlákna a NMJ a také se detekovala přítomnost aktivity komplementu.

Provádění studie Projekt se skládá ze čtyř klinických studií. Zařazení subjektů se provádí společně s personálem ambulancí ALS v nemocnicích po celé republice a subjekty pro kontrolní skupiny jsou zařazeny podle níže uvedeného seznamu míst zařazení.

Weby pro zařazení:

ALS ambulance, Neurologická ambulance, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Kontakt: Vedoucí lékař Elisabeth Elmo Neurologická klinika, Rigshospitalet Glostrup (neurologická kontrolní skupina, CT1+2) Kontakt: Profesor, vedoucí lékař, dr.med. Rigmor Højland Jensen Neurochirurgická klinika, Rigshospitalet (neurologická kontrolní skupina, CT2) Kontakt: Profesor, vedoucí lékař, dr.med. Marianne Juhler ALS ambulance, Neurologická klinika, Bispebjerg Hospital (CT2) Kontakt: Vedoucí lékařka Merete Karlsborg ALS ambulance, Neurologická klinika, Roskilde Hospital (CT2 + 3) Kontakt: Vedoucí Helle Thagesen ALS ambulance, Neurologická klinika, Fakultní nemocnice Odense (CT2) Kontakt: Vedoucí lékař dr.med. Matthias Bode ALS ambulance, Neurologické odd., Aarhus Hospital, Nørrebrogade (Klinická studie 2) Kontakt: vedoucí lékař, Ph.d. Soukromá nemocnice Anette Torvin Gildhøj, Brøndby (neurologicky zdravá kontrolní skupina, klinická studie 2) Kontakt: anesteziolog Niels Anker Pedersen

Výkonové výpočty CT1: Hemolytická aktivita a systém komplementu v ALS plazmě Studie Overgaard et al. (18) zjistili průměrný rozdíl asi 0,20 (SE 0,052 ve skupině ALS, N=20, SD 0,22) v absorbanci (415 nm a 5 hodin inkubace) mezi pacienty s ALS a zdravými bioanalytiky. S α=0,05 og beta=0,20 odpovídající mocnině 0,80 musíme zahrnout 21 subjektů. Za testy, které se považují za možné opuštění a technicky neúspěšné, se výzkumníci rozhodli zahrnout 25 subjektů do každé skupiny. (36)

CT2: Případová-kontrolní studie mapující systém komplementu Počet subjektů v každé skupině je v této případové-kontrolní studii vypočítán s α=0,05 Výzkumníci porovnávají potenciál aktivace komplementu 3 skupin se stejným počtem subjektů v každé. U zdravých jedinců je potenciál aktivace komplementu 100 % s normální oblastí v rozmezí 50-150 % a kde je prevalence nízkého aktivačního potenciálu komplementu (pod 50 %) pod 10 %. Při síle =0,80 je vypočítáno, že je nutné zahrnout 100 subjektů do každé skupiny. Tím je možné nalézt statisticky významné rozdíly mezi skupinami odpovídající poměru šancí 2,3, což by odpovídalo 20 % pacientů s ALS s nízkým potenciálem aktivace komplementu způsobeným zvýšenou aktivitou komplementu. (36)

CT3: Systém komplementu pacientů s ALS v průběhu času – kohortová studie Toto je studie generující hypotézy. Očekává se, že zahrnutých 20 pacientů s ALS v této kohortě bude podskupinou z klinické studie 2. Jako kontrolní skupina na začátku bude použita neurologicky zdravá kontrolní skupina z klinické studie 2.

CT4: Hledání aktivity komplementu v NMJ pacientů s ALS Neexistují žádné předchozí studie popisující aktivitu komplementu v NMJ u žijících lidí. Není tedy důležité provádět výpočet výkonu.

Zpracování dat CT1: Hemolytická aktivita a systém komplementu v ALS plazmě Porovnání stupně hemolýzy mezi pacienty s ALS a kontrolními skupinami se používá t-test a jednosměrná ANOVA. Pro výpočet mezních hodnot vyšetřovatelé používají křivky provozních charakteristik přijímače (ROC).

CT2: Případově-kontrolní studie mapující systém komplementu Porovnání koncentrace komplementu a potenciálu aktivace komplementu mezi pacienty s ALS a kontrolními skupinami je použit t-test a jednosměrná ANOVA. Aby bylo možné vypočítat pravděpodobnost nízkého potenciálu aktivace komplementu ve skupině ALS ve srovnání s kontrolními skupinami, výzkumníci používají logistickou regresi. Pro výpočet mezních hodnot se používají křivky provozních charakteristik přijímače (ROC).

CT3: Systém komplementu u pacientů s ALS v průběhu času – kohortová studie Stejně jako v klinické studii 2. Dále byla provedena regresní analýza aktivity komplementu jako funkce času od začátku ALS, pohlaví, věku, podtypu onemocnění a progrese onemocnění. provedl.

CT4: Hledání aktivity komplementu v NMJ pacientů s ALS Stejně jako v CT2. Stupeň ukládání komplementu a svalová patologie je popsán kvalitativně a je provedeno zaslepené skórování v "normálním", "lehkém stupni" a "závažném stupni" změn. To bude kvantitativně porovnáno s 2 x K tabulkami a neparametrickými statistikami.

Šíření výsledků Výsledky projektu budou publikovány v mezinárodních recenzovaných časopisech. Budou zveřejněny pozitivní i negativní poznatky.

Perspektivace Se zřízením velké národní biobanky pro výzkum ALS bude možné provádět mnoho budoucích výzkumných projektů. Nepřetržitý výzkum ALS je pro pacienty s ALS prvořadý na národní i mezinárodní úrovni, aby byla zachována naděje na účinnou lékařskou léčbu tohoto agresivního onemocnění, která bude nalezena v budoucnosti.