Amyotrophe Lateralsklerose und das angeborene Immunsystem

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fortschreitende, tödliche, neurodegenerative Erkrankung, die die oberen und unteren Motoneuronen betrifft. Dies führt zu tiefgreifender Muskeldystrophie, Hyperreflexie, Faszikulationen und Paresen der bulbären sowie der Skelettmuskulatur. ALS verursacht eine zunehmende körperliche Ermüdung und die Patienten werden bald bettlägerig und die Atmung unzureichend. Die Diagnose ALS wird gemäß El Escorial revisited gestellt. Häufig müssen klinische und neurophysiologische Tests wiederholt werden (1-4).

In Dänemark beträgt die Inzidenz von ALS 1-2/100.000 und die Prävalenz beträgt 4-6/100.000. Die durchschnittliche Überlebenszeit ab Diagnosestellung beträgt 3 Jahre, jedoch mit großer Varianz. (5+6)

Heute ist die Pathogenese noch unbekannt und keine Behandlung kann das Fortschreiten der ALS aufhalten. Die Behandlung mit Riluzol scheint die mediane Überlebenszeit um 2 oder 3 Monate zu verlängern (7).

Höchstwahrscheinlich erfordert eine zukünftige medizinische Behandlung ein besseres Verständnis der Pathogenese sowie der Pathophysiologie von ALS. Diese vorliegende Studie zielt darauf ab, dies basierend auf der Hypothese zu tun, dass ALS teilweise oder vollständig durch Komplementaktivierung verursacht wird.

Das Komplementsystem ist ein komplexes System, das aus Proteinen im Plasma sowie membrangebundenen Proteinen besteht, die zusammen das Antikörper-basierte Immunsystem ergänzen. Das Komplementsystem ist ein sich selbst erhaltendes Kaskadensystem, das über verschiedene Wege aktiviert wird. Es wirkt durch Opsonisierung, bei der Komplementproteine ​​an Mikroorganismen binden, um Granulozyten, Monozyten und Makrophagen zu aktivieren und anzugreifen. Das Komplementsystem bewirkt auch eine Zytolyse von Mikroorganismen über MAC (Membranangriffskomplex) durch Aktivierung der Mastzellen. Es inaktiviert und eliminiert auch ausgebrannte Immunkomplexe und führt eine apoptotische Erneuerung durch.

Eine kürzlich durchgeführte Pilotstudie zu Neuromyelitis Optica hat gezeigt, dass das Komplementsystem eine zentrale Rolle bei der Pathogenese einer Krankheit spielt, die zuvor fälschlicherweise als Frühstadium der Disseminierten Sklerose angesehen wurde. Diese Ergebnisse führten zu einer medikamentösen Behandlung mit Antikomplement (Equlizumab) mit vielversprechenden Ergebnissen (8). Es ist möglich, dass ähnliche pathogenetische Mechanismen die molekulare Grundlage von ALS sein könnten.

Verschiedene Forschungsgruppen haben versucht aufzuklären, wie das Immunsystem am Fortschreiten der ALS beteiligt ist (9-35). Mehrere Studien stützen die Hypothese, dass das Komplementsystem von entscheidender Bedeutung für den Ausbruch und das Fortschreiten der ALS ist. (9-28)

In mehreren klinischen Studien mit ALS-Plasma wurde der Schluss gezogen, dass ALS-Plasma zytotoxisch ist, wenn es mit gesunden roten Blutkörperchen oder gesundem Nervengewebe inkubiert wird. Einige Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Zytotoxizität durch das Komplementsystem verursacht wird. Die Ergebnisse können jedoch nicht in allen klinischen Studien konsequent reproduziert werden. Diese Versuche wurden vor Jahrzehnten durchgeführt, als die Methoden zum Nachweis der Komplementaktivität begrenzt waren. (9-14)

Mehrere Tierversuche weisen darauf hin, dass ALS in den neuromuskulären Verbindungen (NMJ) beginnt und daher als distale Axonopathie und nicht als zentrale neurologische Erkrankung betrachtet werden sollte, was heute die allgemeine Wahrnehmung von ALS ist. (27-31)

Das Ziel des Projekts Ziel ist es, das Wissen über die Pathophysiologie der Krankheit ALS zu erweitern, da dies uns möglicherweise einer gezielten medizinischen Behandlung näher bringen kann.

Die Projektgruppe will untersuchen, ob eine zuvor gefundene, einzigartige Zytotoxizität im ALS-Plasma wiederhergestellt werden kann (9-14). Ist dies der Fall, so ist es mit modernen Methoden heute möglich nachzuweisen, ob das Immunsystem im Allgemeinen und insbesondere das Komplementsystem diese Zytotoxizität verursacht.

Die Einrichtung eines nationalen Forschungsprojekts über ALS und das Komplementsystem durch die Einrichtung einer Forschungsbiobank mit systematisch gesammeltem Blut und Rückenmarksflüssigkeit von ALS-Patienten aus dem ganzen Land wird die Möglichkeit bieten, herauszufinden, ob das Komplementsystem eine Rolle bei der Entstehung spielt und Progression von ALS.

Darüber hinaus wird eine Pilotstudie durchgeführt, um zu untersuchen, ob bei Patienten mit ALS eine Komplementaktivität im NMJ vorliegt, wie dies in einer Studie an ALS-Mäusen gezeigt wurde. (28)

Die Hypothesen

1. ALS ist gekennzeichnet durch eine abnorme Immunantwort mit Zytotoxizität und erhöhter Komplementaktivität im Plasma, die sich wie folgt zeigt:

   1. Plasma von Patienten mit ALS zeigt eine erhöhte hämolytische Aktivität, wenn es mit roten Blutkörperchen von gesunden Probanden inkubiert wird.
   2. Die Komplementaktivität ist im Plasma von ALS-Patienten im Vergleich zu Plasma von neurologisch gesunden Probanden und Probanden mit anderen neurologischen Erkrankungen erhöht.
   3. Die hämolytische Aktivität im Plasma von ALS-Patienten korreliert mit der Komplementaktivität.
2. Rückenmarksflüssigkeit von ALS-Patienten enthält eine erhöhte Komplementaktivität im Vergleich zu Rückenmarksflüssigkeit von neurologisch gesunden Probanden und von Probanden mit anderen neurologischen Erkrankungen.

Patienten, Materialien und Methoden:

Klinische Studie 1 (CT1): Hämolytische Aktivität und das Komplementsystem in ALS-Plasma

Anzahl der Probanden: 25 Patienten mit ALS, 25 Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen, 25 gesunde Freiwillige

Ablauf von CT1: Jedem Patienten wird eine Blutprobe entnommen. Dabei werden die roten Blutkörperchen und der flüssige Teil des Blutes, das Plasma, getrennt. Die roten Blutkörperchen von verschiedenen Subjekten werden im Plasma eines anderen Subjekts inkubiert. Derselbe Versuchsverlauf wird nach Inaktivierung des vorliegenden Komplementsystems sowohl durch Hitze als auch durch Anti-Komplement wiederholt.

Klinische Studie 2 (CT2): Fall-Kontroll-Studie zur Kartierung des Komplementsystems

Anzahl der Probanden: 100 Patienten mit ALS, 100 Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen und 100 neurologisch gesunde Patienten

Der Verlauf von CT2:Blutproben und Liquor werden aufbereitet und anschließend in einer Forschungsbiobank eingefroren. Anschließend werden die Proben der 3 Probandengruppen analysiert und mit Fokus auf das Komplementsystem verglichen: Im biologischen Material wird das Komplementaktivierungspotential gemessen. Es wird ein Zytokinprofil erstellt sowie die Akute-Phase-Reaktanten durch Multiplex-Assays kartiert. Weiterhin wird das RNA-Expressionsprofil auf einem später mit RNA stabilisierten Zellpellet erstellt.

Klinische Studie 3 (CT3): Das Komplementsystem von ALS-Patienten im Zeitverlauf – eine Kohortenstudie Anzahl der Probanden: 20 Patienten mit ALS (Untergruppe von CT2)

Der Kurs von CT3: Alle sechs Monate wird der Kurs von CT2 wiederholt. Die Aktivität des Komplementsystems bei jedem Patienten mit ALS wird im Verlauf der Krankheit analysiert.

Klinische Studie 4 (CT4): Suche nach Komplementaktivität im NMJ von ALS-Patienten

Anzahl der Probanden: 10 Patienten mit ALS

Ablauf von CT4: Die Muskelbiopsien werden entnommen und sofort in die Abt. gebracht. der Pathologie am Rigshospitalet. Dann werden dünne Gewebeschichten gefärbt, um die Muskelfasern und die NMJ zu analysieren sowie das Vorhandensein von Komplementaktivität nachzuweisen.

Durchführung der Studie Das Projekt besteht aus vier klinischen Studien. Die Aufnahme der Probanden erfolgt zusammen mit dem Personal in ALS-Ambulanzen in Krankenhäusern im ganzen Land, und die Probanden für die Kontrollgruppen werden gemäß der Liste der Einschlussstellen unten aufgenommen.

Inklusionsseiten:

ALS-Ambulanz, Neurologische Klinik, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Kontakt: Chefärztin Elisabeth Elmo Neurologische Klinik, Rigshospitalet Glostrup (neurologische Kontrollgruppe, CT1+2) Kontakt: Professor, Chefarzt, dr.med. Rigmor Højland Jensen Neurochirurgische Klinik, Rigshospitalet (neurologische Kontrollgruppe, CT2) Kontakt: Professor, Chefarzt, dr.med. Marianne Juhler ALS-Ambulanz, Neurologische Abt., Bispebjerg Krankenhaus (CT2) Kontakt: Chefärztin Merete Karlsborg ALS-Ambulanz, Neurologische Abt., Roskilde Krankenhaus (CT2 + 3) Kontakt: Chefärztin Helle Thagesen ALS-Ambulanz, Neurologische Abt., Universitätskrankenhaus Odense (CT2) Kontakt: Chefarzt, dr.med. Matthias Bode ALS-Ambulanz, Neurologische Abteilung, Aarhus-Krankenhaus, Nørrebrogade (Klinische Studie 2) Kontakt: Chefarzt, Ph.d. Anette Torvin Gildhøj Private Hospital, Brøndby (Neurologisch gesunde Kontrollgruppe, Klinische Studie 2) Kontakt: Anästhesist Niels Anker Pedersen

Power-Berechnungen CT1: Hämolytische Aktivität und das Komplementsystem im ALS-Plasma Die Studie Overgaard et al. (18) fanden einen mittleren Unterschied von etwa 0,20 (SE 0,052 in der ALS-Gruppe, N=20, SD 0,22) in der Extinktion (415 nm und 5 Stunden Inkubation) zwischen ALS-Patienten und gesunden Bioanalytikern. Mit α=0,05 und Beta=0,20, was einer Potenz von 0,80 entspricht, müssen wir 21 Probanden einbeziehen. Da mögliche Studienabbrecher und technisch fehlgeschlagene Tests als Tests betrachtet werden, wählen die Ermittler 25 Probanden in jeder Gruppe aus. (36)

CT2: Fall-Kontroll-Studie, die das Komplementsystem abbildet Die Anzahl der Probanden in jeder Gruppe wird in dieser Fall-Kontroll-Studie mit α=0,05 berechnet. Die Forscher vergleichen das Komplementaktivierungspotential von 3 Gruppen mit jeweils der gleichen Anzahl an Probanden. Bei gesunden Probanden beträgt das Komplementaktivierungspotential 100 % mit einem Normalbereich von 50–150 % und einem niedrigen Komplementaktivierungspotential (unter 50 %), das unter 10 % liegt. Mit Power = 0,80 wird berechnet, dass es notwendig ist, 100 Probanden in jede Gruppe aufzunehmen. Dabei lassen sich statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen finden, die einem Odds Ratio von 2,3 entsprechen, was einem niedrigen Komplementaktivierungspotential von 20 % der ALS-Patienten durch erhöhte Komplementaktivität entsprechen würde. (36)

CT3: Das Komplementsystem von ALS-Patienten im Zeitverlauf – eine Kohortenstudie Dies ist eine hypothesengenerierende Studie. Es wird erwartet, dass die eingeschlossenen 20 ALS-Patienten in dieser Kohorte eine Untergruppe aus klinischer Studie 2 sein werden. Als Ausgangskontrollgruppe wird die neurologisch gesunde Kontrollgruppe aus klinischer Studie 2 verwendet.

CT4: Suche nach Komplementaktivität im NMJ von ALS-Patienten Es gibt keine früheren Studien, die die Komplementaktivität im NMJ bei lebenden Menschen beschreiben. Eine Leistungsberechnung ist daher nicht relevant.

Datenverarbeitung CT1: Hämolytische Aktivität und das Komplementsystem in ALS-Plasma Zum Vergleich des Hämolysegrades zwischen den ALS-Patienten und den Kontrollgruppen werden t-Test und Einweg-ANOVA verwendet. Zur Berechnung der Cut-off-Werte verwenden die Forscher sogenannte Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven.

CT2: Fall-Kontroll-Studie zur Kartierung des Komplementsystems Vergleich der Komplementkonzentration und des Komplementaktivierungspotentials zwischen ALS-Patienten und den Kontrollgruppen t-Test und einfache ANOVA werden verwendet. Um die Chancen für ein niedriges Komplementaktivierungspotential in der ALS-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollgruppen zu berechnen, verwenden die Forscher die logistische Regression. Zur Berechnung der Cut-off-Werte werden Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven verwendet.

CT3: Das Komplementsystem von ALS-Patienten im Zeitverlauf – eine Kohortenstudie Wie in Clinical Trial 2. Des Weiteren erfolgt eine Regressionsanalyse der Komplementaktivität als Funktion der Zeit seit Beginn der ALS, des Geschlechts, des Alters, des Krankheitssubtyps und des Krankheitsverlaufs durchgeführt.

CT4: Suche nach Komplementaktivität im NMJ von ALS-Patienten Wie in CT2. Der Grad der Komplementablagerung und Muskelpathologie wird qualitativ beschrieben und ein verblindetes Scoring in „normale“, „leichte“ und „schwere“ Veränderungen durchgeführt. Dies wird quantitativ mit 2 x K-Tabellen und nichtparametrischer Statistik verglichen.

Verbreitung der Ergebnisse Die Ergebnisse des Projekts werden in internationalen Peer-Review-Zeitschriften veröffentlicht. Sowohl positive als auch negative Ergebnisse werden veröffentlicht.

Perspektive Mit der Einrichtung einer großen nationalen ALS-Forschungsbiobank wird es möglich sein, viele zukünftige Forschungsprojekte durchzuführen. Kontinuierliche ALS-Forschung ist sowohl national als auch international für ALS-Patienten von größter Bedeutung, um die Hoffnung auf eine effiziente medizinische Behandlung dieser aggressiven Krankheit in der Zukunft aufrechtzuerhalten.