Боковой амиотрофический склероз и врожденная иммунная система

Боковой амиотрофический склероз (БАС) — прогрессирующее смертельное нейродегенеративное заболевание, поражающее верхние и нижние двигательные нейроны. Это приводит к глубокой мышечной дистрофии, гиперрефлексии, фасцикуляциям и парезу бульбарной, а также скелетной мускулатуры. БАС вызывает нарастающую физическую усталость, и пациенты вскоре становятся прикованными к постели и дыхательной недостаточностью. Диагноз БАС ставится в соответствии с пересмотренным Эль-Эскориалом. Часто необходимо повторить клинические и нейрофизиологические тесты (1-4).

В Дании заболеваемость БАС составляет 1-2 случая на 100 000 человек. и распространенность 4-6/100.000. Среднее время выживания с момента постановки диагноза составляет 3 года, но с большим разбросом. (5+6)

Сегодня патогенез до сих пор неизвестен, и никакое лечение не может остановить прогрессирование БАС. Лечение рилузолом увеличивает среднее время выживания на 2 или 3 месяца (7).

Скорее всего, будущее лечение требует лучшего понимания патогенеза, а также патофизиологии БАС. Это настоящее исследование направлено на то, чтобы сделать это на основе гипотезы о том, что БАС частично или полностью вызван активацией комплемента.

Система комплемента представляет собой сложную систему, состоящую из белков плазмы, а также мембраносвязанных белков, которые вместе дополняют иммунную систему, основанную на антителах. Система комплемента представляет собой самовоспроизводящуюся каскадную систему, которая активируется различными путями. Он работает путем опсонизации, когда белки комплемента связываются с микроорганизмами, чтобы активировать и нацеливать гранулоциты, моноциты и макрофаги. Система комплемента также вызывает цитолиз микроорганизмов через MAC (мембраноатакующий комплекс) за счет активации тучных клеток. Он также инактивирует и устраняет сгоревшие иммунные комплексы, а также выполняет апоптотическое обновление.

Недавнее экспериментальное исследование нейромиелита оптика показало, что система комплемента играет центральную роль в патогенезе заболевания, которое ранее ошибочно воспринималось как ранняя стадия рассеянного склероза. Эти результаты привели к медикаментозному лечению антикомплементарными препаратами (эклизумаб) с многообещающими результатами (8). Не исключено, что подобные патогенетические механизмы могут лежать в молекулярной основе БАС.

Различные исследовательские группы пытались выяснить, как иммунная система участвует в прогрессировании БАС (9-35). Несколько исследований подтверждают гипотезу о том, что система комплемента имеет решающее значение для возникновения и прогрессирования БАС. (9-28)

В нескольких клинических испытаниях плазмы БАС был сделан вывод, что плазма БАС цитотоксична при инкубации со здоровыми эритроцитами или здоровой нервной тканью. Некоторые исследования показывают, что цитотоксичность вызывается системой комплемента. Однако результаты не могут быть последовательно воспроизведены во всех клинических испытаниях. Эти испытания проводились несколько десятилетий назад, когда методы определения активности комплемента были ограничены. (9-14)

Несколько испытаний на животных показывают, что БАС начинается в нервно-мышечных соединениях (НМС) и, следовательно, его следует рассматривать как дистальную аксонопатию, а не как центральное неврологическое заболевание, как сегодня принято считать БАС. (27-31)

Цель проекта Цель состоит в том, чтобы расширить знания о патофизиологии болезни БАС, поскольку это, возможно, может приблизить нас к целенаправленному лечению.

Группа проекта хочет выяснить, можно ли восстановить ранее обнаруженную уникальную цитотоксичность в плазме БАС (9-14). Если это так, то современные методы позволяют определить, является ли иммунная система в целом и, в частности, система комплемента причиной этой цитотоксичности.

Создание национального исследовательского проекта по БАС и системе комплемента путем создания исследовательского биобанка с систематическим сбором крови и спинномозговой жидкости от пациентов с БАС со всей страны обеспечит возможность выяснить, играет ли система комплемента роль в возникновении и прогрессирование БАС.

Кроме того, будет проведено пилотное исследование с целью выяснить, есть ли активность комплемента в СНС у пациентов с БАС, как это было показано в исследовании мышей с БАС. (28)

Гипотезы

1. БАС характеризуется аномальным иммунным ответом с цитотоксичностью и повышенной активностью комплемента в плазме, что проявляется в следующем:

   1. Плазма пациентов с БАС проявляет повышенную гемолитическую активность при инкубации с эритроцитами здоровых людей.
   2. Активность комплемента повышена в плазме пациентов с БАС по сравнению с плазмой неврологически здоровых субъектов и субъектов с другими неврологическими заболеваниями.
   3. Гемолитическая активность в плазме больных БАС коррелирует с активностью комплемента.
2. Спинномозговая жидкость пациентов с БАС содержит повышенную активность комплемента по сравнению со спинномозговой жидкостью неврологически здоровых субъектов и субъектов с другими неврологическими заболеваниями.

Пациенты, материалы и методы:

Клиническое испытание 1 (CT1): гемолитическая активность и система комплемента в плазме БАС

Количество испытуемых: 25 пациентов с БАС, 25 пациентов с другими неврологическими заболеваниями, 25 здоровых добровольцев.

Ход КТ1: У каждого пациента берется образец крови. Красные кровяные тельца и жидкая часть крови, плазма, разделяются. Эритроциты от разных субъектов инкубируют в плазме другого субъекта. Тот же самый курс испытаний повторяют после инактивации данной системы комплемента как нагреванием, так и антикомплементом.

Клиническое испытание 2 (CT2): исследование случай-контроль, направленное на картирование системы комплемента.

Количество испытуемых: 100 пациентов с БАС, 100 пациентов с другими неврологическими заболеваниями и 100 неврологически здоровых пациентов.

Курс CT2: Образцы крови и спинномозговой жидкости готовятся, а затем замораживаются в исследовательском биобанке. Затем образцы от 3 групп испытуемых анализируют и сравнивают, ориентируясь на систему комплемента: В биологическом материале измеряют потенциал активации комплемента. Составляется цитокиновый профиль, а также картирование реагентов острой фазы с помощью мультиплексных анализов. Кроме того, профиль экспрессии РНК создается на клеточном осадке, позже стабилизированном РНК.

Клиническое исследование 3 (CT3): Система комплемента у пациентов с БАС с течением времени — когортное исследование. Количество субъектов: 20 пациентов с БАС (подгруппа из CT2).

Курс КТ3: Каждые 6 месяцев повторяется курс из КТ2. Активность системы комплемента у каждого больного БАС анализируют по мере прогрессирования заболевания.

Клиническое испытание 4 (CT4): Поиск активности комплемента в нейросетевом суставе у пациентов с БАС

Количество субъектов: 10 пациентов с БАС.

Ход КТ4: Берут биоптаты мышц и сразу же доставляют в отд. патологии в Ригшоспиталете. Затем окрашивают тонкие слои ткани для анализа мышечных волокон и НМС, а также для выявления присутствия активности комплемента.

Проведение исследования Проект состоит из четырех клинических испытаний. Включение субъектов осуществляется совместно с персоналом амбулаторных клиник с БАС в больницах по всей стране, а субъекты контрольных групп включаются в соответствии со списком мест включения, приведенным ниже.

Сайты включения:

Амбулатория БАС, Неврологическая клиника, Ригшоспиталет Глоструп (CT1+2+3+4) Контактное лицо: Главный врач Элизабет Эльмо ​​Неврологическая клиника, Ригшоспиталет Глоструп (группа неврологического контроля, CT1+2) Контактное лицо: Профессор, Главный врач, д.м.н. Ригмор Хёйланд Нейрохирургическая клиника Йенсена, Ригшоспиталет (группа неврологического контроля, CT2) Контактное лицо: профессор, главный врач, д.м.н. Марианна Юлер Амбулатория БАС, Неврологическое отделение, Больница Биспебьерг (CT2) Контактное лицо: Главный врач Мерете Карлсборг Амбулатория БАС, Неврологическое отделение, Больница Роскилле (CT2 + 3) Контактное лицо: Главный врач Хелле Тагесен Амбулатория БАС, Неврологическое отделение, Университетская больница Оденсе (CT2) Контактное лицо: Главный врач, д.м.н. Матиас Боде Амбулаторная клиника БАС, Неврологическое отделение, Орхусская больница, Нёрреброгаде (Клиническое испытание 2) Контактное лицо: главный врач, к.м.н. Частная больница Anette Torvin Gildhøj, Брондбю (неврологически здоровая контрольная группа, клиническое испытание 2) Контактное лицо: анестезиолог Нильс Анкер Педерсен

Расчет мощности CT1: гемолитическая активность и система комплемента в плазме БАС Исследование Overgaard et al. (18) обнаружили среднюю разницу около 0,20 (SE 0,052 в группе БАС, N=20, SD 0,22) в абсорбции (415 нм и 5 часов инкубации) между пациентами с БАС и здоровыми биоаналитиками. При α=0,05 и бета=0,20, что соответствует мощности 0,80, нам нужно включить 21 субъекта. Поскольку возможные выпадения и технически неудачные тесты считаются тестами, исследователи включают по 25 испытуемых в каждую группу. (36)

CT2: Исследование случай-контроль, отображающее систему комплемента Количество субъектов в каждой группе в этом исследовании случай-контроль рассчитано с α=0,05. Исследователи сравнивают потенциал активации комплемента в 3 группах с одинаковым количеством субъектов в каждой. У здоровых людей потенциал активации комплемента составляет 100 % с нормальной площадью в пределах 50–150 %, а распространенность низкого потенциала активации комплемента (ниже 50 %) составляет менее 10 %. При мощности =0,80 рассчитано, что в каждую группу необходимо включить 100 испытуемых. Таким образом, можно найти статистически значимые различия между группами, соответствующие отношению шансов 2,3, что соответствует 20 % пациентов с БАС, имеющим низкий потенциал активации комплемента, вызванный повышенной активностью комплемента. (36)

CT3: Система комплемента у пациентов с БАС с течением времени — когортное исследование. Это исследование, генерирующее гипотезу. Ожидается, что 20 пациентов с БАС, включенных в эту когорту, будут частью клинического исследования 2. В качестве контрольной группы на исходном уровне будет использоваться неврологически здоровая контрольная группа из клинического исследования 2.

CT4: Поиск активности комплемента в НМС у пациентов с БАС Ранее не проводилось исследований, описывающих активность комплемента в НМС у живых людей. Поэтому нет смысла делать расчет мощности.

Обработка данных CT1: Гемолитическая активность и система комплемента в плазме крови с БАС Сравнение степени гемолиза между пациентами с БАС и контрольной группой. Используются t-критерий и однофакторный дисперсионный анализ. Для расчета пороговых значений исследователи используют кривые рабочих характеристик приемника (ROC).

CT2: Исследование случай-контроль, картирование системы комплемента. Сравнение концентрации комплемента и потенциала активации комплемента между пациентами с БАС и контрольными группами. Используются t-критерий и односторонний ANOVA. Чтобы рассчитать вероятность низкого потенциала активации комплемента в группе БАС по сравнению с контрольными группами, исследователи использовали логистическую регрессию. Для расчета пороговых значений используются кривые рабочих характеристик приемника (ROC).

CT3: Система комплемента у пациентов с БАС с течением времени — когортное исследование. Как и в клиническом испытании 2. Кроме того, регрессионный анализ активности комплемента в зависимости от времени, прошедшего с начала БАС, пола, возраста, подтипа заболевания и прогрессирования заболевания. проведенный.

CT4: Поиск активности комплемента в NMJ пациентов с БАС Как и в CT2. Качественно описывают степень отложения комплемента и мышечную патологию и проводят слепую оценку в «нормальной», «легкой степени» и «тяжелой степени» изменений. Это будет количественно сравниваться с таблицами 2 x K и непараметрической статистикой.

Распространение результатов Результаты проекта будут опубликованы в международных рецензируемых журналах. Будут опубликованы как положительные, так и отрицательные результаты.

Перспективы С созданием крупного национального исследовательского биобанка БАС станет возможным проведение многих будущих исследовательских проектов. Непрерывные исследования БАС имеют первостепенное значение для пациентов с БАС как на национальном, так и на международном уровне, чтобы сохранить надежду на эффективное лечение этого агрессивного заболевания в будущем.