La esclerosis lateral amiotrófica y el sistema inmunológico innato

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva y mortal que afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores. Esto conduce a distrofia muscular profunda, hiperreflexia, fasciculaciones y paresia de la musculatura bulbar y esquelética. La ELA provoca un aumento de la fatiga física y los pacientes pronto quedan postrados en cama y con insuficiencia respiratoria. El diagnóstico de ELA se realiza según la revisión de El Escorial. A menudo es necesario repetir las pruebas clínicas y neurofisiológicas (1-4).

En Dinamarca la incidencia de ELA es 1-2/100.000 y la prevalencia es 4-6/100.000. El tiempo medio de supervivencia desde el momento del diagnóstico es de 3 años pero con una gran variación. (5+6)

Hoy en día, la patogenia aún se desconoce y ningún tratamiento puede detener la progresión de la ELA. El tratamiento con riluzol parece prolongar la mediana de supervivencia hasta 2 o 3 meses (7).

Lo más probable es que un futuro tratamiento médico requiera una mejor comprensión de la patogenia y la fisiopatología de la ELA. El presente estudio pretende hacerlo basándose en la hipótesis de que la ELA es causada parcial o totalmente por la activación del complemento.

El sistema del complemento es un sistema complejo que consta de proteínas en el plasma, así como proteínas unidas a la membrana que, en conjunto, complementan el sistema inmunitario basado en anticuerpos. El sistema del complemento es un sistema en cascada que se perpetúa a sí mismo y se activa a través de diferentes vías. Funciona por opsonización, donde las proteínas del complemento se unen a los microorganismos para activar y atacar a los granulocitos, monocitos y macrófagos. El sistema del complemento también provoca la citólisis de microorganismos a través de MAC (complejo de ataque de membrana) por activación de los mastocitos. También inactiva y elimina los complejos inmunes quemados además de realizar la renovación apoptótica.

Un estudio piloto reciente de Neuromyelitis Optica ha demostrado cómo el sistema del complemento juega un papel central en la patogénesis de una enfermedad que anteriormente se percibía erróneamente como una etapa temprana de la esclerosis diseminada. Estos hallazgos dieron como resultado un tratamiento médico con anticomplemento (equlizumab) con resultados prometedores (8). Es posible que mecanismos patogénicos similares puedan ser la base molecular de la ELA.

Diferentes grupos de investigación han tratado de esclarecer cómo el sistema inmunitario está involucrado en la progresión de la ELA (9-35). Varios estudios apoyan la hipótesis de que el sistema del complemento tiene una importancia crucial para la aparición y progresión de la ELA. (9-28)

En varios ensayos clínicos con plasma ALS se concluye que el plasma ALS es citotóxico cuando se incuba con glóbulos rojos sanos o tejido nervioso sano. Algunas investigaciones indican que la citotoxicidad es causada por el sistema del complemento. Sin embargo, los resultados no pueden reproducirse en todos los ensayos clínicos. Estos ensayos se realizaron hace décadas cuando los métodos para detectar la actividad del complemento eran limitados. (9-14)

Varios ensayos con animales indican que la ELA comienza en las uniones neuromusculares (UNM) y, por lo tanto, debe considerarse una axonopatía distal en lugar de una enfermedad neurológica central, que hoy en día es la percepción general de la ELA. (27-31)

El propósito del proyecto El objetivo es aumentar el conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad ELA ya que esto posiblemente nos pueda acercar a un tratamiento médico específico.

El grupo del proyecto quiere investigar si se puede recuperar una citotoxicidad única encontrada previamente en el plasma de ALS (9-14). Si este es el caso, entonces los métodos modernos de hoy en día permiten detectar si el sistema inmunológico en general, y en particular el sistema del complemento, está causando esta citotoxicidad.

El establecimiento de un proyecto de investigación nacional sobre la ELA y el sistema del complemento mediante la creación de un biobanco de investigación con sangre y líquido cefalorraquídeo recolectados sistemáticamente de pacientes con ELA de todo el país garantizará la oportunidad de averiguar si el sistema del complemento juega un papel en la aparición y progresión de la ELA.

Además, se llevará a cabo un estudio piloto con el fin de investigar si existe actividad del complemento en la UNM en pacientes con ELA, como se ha demostrado en un estudio con ratones con ELA. (28)

las hipótesis

1. La ELA se caracteriza por una respuesta inmunitaria anormal con citotoxicidad y aumento de la actividad del complemento en el plasma que se revela por lo siguiente:

   1. El plasma de pacientes con ELA muestra una mayor actividad hemolítica cuando se incuba con glóbulos rojos de sujetos sanos.
   2. La actividad del complemento aumenta en el plasma de pacientes con ELA en comparación con el plasma de sujetos neurológicamente sanos y sujetos con otras enfermedades neurológicas.
   3. La actividad hemolítica en el plasma de pacientes con ELA se correlaciona con la actividad del complemento.
2. El líquido cefalorraquídeo de pacientes con ELA contiene una mayor actividad del complemento en comparación con el líquido cefalorraquídeo de sujetos neurológicamente sanos y de sujetos con otras enfermedades neurológicas.

Pacientes, materiales y métodos:

Ensayo clínico 1(CT1): Actividad hemolítica y sistema del complemento en plasma de ELA

Número de sujetos: 25 pacientes con ELA, 25 pacientes con otra enfermedad neurológica, 25 voluntarios sanos

El curso de CT1: Se toma una muestra de sangre de cada paciente. Se separan los glóbulos rojos y la parte líquida de la sangre, el plasma. Los glóbulos rojos de diferentes sujetos se incuban en el plasma de otro sujeto. El mismo curso de prueba se repite después de la inactivación del presente sistema del complemento tanto por calor como por anticomplemento.

Ensayo clínico 2 (CT2): estudio de casos y controles con el objetivo de mapear el sistema del complemento

Número de sujetos: 100 pacientes con ELA, 100 pacientes con otra enfermedad neurológica y 100 pacientes neurológicamente sanos

El curso de CT2: Las muestras de sangre y líquido cefalorraquídeo se preparan y luego se congelan en un biobanco de investigación. Luego, las muestras de los 3 grupos de sujetos se analizan y comparan centrándose en el sistema del complemento: Se mide el potencial de activación del complemento en el material biológico. Se elabora un perfil de citocinas y se mapean los reactivos de fase aguda mediante ensayos multiplex. Además, el perfil de expresión de ARN se realiza en un sedimento celular estabilizado posteriormente con ARN.

Ensayo clínico 3 (CT3): el sistema de complemento de pacientes con ELA a lo largo del tiempo: un estudio de cohortes Número de sujetos: 20 pacientes con ELA (subconjunto de CT2)

El curso de CT3: Cada seis meses se repite el curso del CT2. Se analiza la actividad del sistema del complemento en cada paciente con ELA a medida que avanza la enfermedad.

Ensayo clínico 4(CT4): Búsqueda de actividad del complemento en la UNM de pacientes con ELA

Número de sujetos: 10 pacientes con ELA

El curso de CT4: Se toman las biopsias musculares y se llevan inmediatamente al Dep. de Patología del Rigshospitalet. Luego, se tiñen capas delgadas de tejido para analizar las fibras musculares y la UNM, así como para detectar la presencia de actividad del complemento.

Realización del estudio El proyecto consta de cuatro ensayos clínicos. La inclusión de los sujetos se realiza junto con el personal de las clínicas ambulatorias de ELA en hospitales de todo el país y los sujetos para los grupos de control se incluyen de acuerdo con la lista de sitios de inclusión a continuación.

Sitios de inclusión:

Clínica ambulatoria ALS, Clínica neurológica, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Contacto: Médico jefe Elisabeth Elmo Clínica neurológica, Rigshospitalet Glostrup (grupo de control neurológico, CT1+2) Contacto: Profesor, Médico jefe, dr.med. Rigmor Højland Jensen Neurosurgical Clinic, Rigshospitalet (grupo de control neurológico, CT2) Contacto: Profesor, médico jefe, dr.med. Clínica ambulatoria Marianne Juhler ALS, Dep. Neurológico, Hospital Bispebjerg (CT2) Contacto: Médico jefe Merete Karlsborg Clínica ambulatoria ALS, Dep. Neurológico, Hospital Roskilde (CT2 + 3) Contacto: Médico jefe Clínica ambulatoria ALS Helle Thagesen, Dep. Neurológico, Hospital Universitario de Odense (CT2) Contacto: Médico jefe, dr.med. Clínica ambulatoria Matthias Bode ALS, Departamento neurológico, Aarhus Hospital, Nørrebrogade (Ensayo clínico 2) Contacto: Médico jefe, ph.d. Anette Torvin Gildhøj Private Hospital, Brøndby (grupo de control neurológicamente sano, ensayo clínico 2) Contacto: anestesiólogo Niels Anker Pedersen

Cálculos de potencia CT1: actividad hemolítica y sistema del complemento en plasma de ELA El estudio Overgaard et al. (18) encontraron una diferencia media de alrededor de 0,20 (SE 0,052 en el grupo ELA, N=20, DT 0,22) en la absorbancia (415 nm y 5 horas de incubación) entre pacientes con ELA y bioanalistas sanos. Con α=0,05 og beta=0,20 correspondiente a potencia 0,80 necesitamos incluir 21 sujetos. Como posibles abandonos y técnicamente reprobados se consideran pruebas que los investigadores optan por incluir 25 sujetos en cada grupo. (36)

CT2: Estudio de casos y controles mapeando el sistema del complemento El número de sujetos en cada grupo se calcula en este estudio de casos y controles con α=0,05 Los investigadores comparan el potencial de activación del complemento de 3 grupos con la misma cantidad de sujetos en cada uno. En sujetos sanos el potencial de activación del complemento es del 100 % con un área normal que oscila entre el 50-150 % y donde la prevalencia de bajo potencial de activación del complemento (menos del 50 %) es inferior al 10 %. Con potencia =0,80 se calcula que es necesario incluir 100 sujetos en cada grupo. De esta manera es posible encontrar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos correspondientes a un odds ratio de 2,3, lo que correspondería a un 20 % de pacientes con ELA que tienen un potencial de activación del complemento bajo causado por una mayor actividad del complemento. (36)

CT3: El sistema del complemento de los pacientes con ELA a lo largo del tiempo: un estudio de cohortes Este es un estudio generador de hipótesis. Se espera que los 20 pacientes con ELA incluidos en esta cohorte sean un subconjunto del Ensayo clínico 2. Como grupo de control al inicio, se utilizará el grupo de control neurológicamente sano del Ensayo clínico 2.

CT4: Búsqueda de actividad del complemento en la UNM de pacientes con ELA No hay estudios previos que describan la actividad del complemento en la UNM en seres humanos vivos. Por lo tanto, no es relevante hacer un cálculo de potencia.

Procesamiento de datos CT1: Actividad hemolítica y sistema del complemento en plasma con ELA Comparación del grado de hemólisis entre los pacientes con ELA y los grupos de control Se utilizan la prueba t y ANOVA de una vía. Para calcular los valores de corte, los investigadores utilizan curvas de características operativas del receptor (ROC).

CT2: estudio de casos y controles mapeando el sistema del complemento Comparando la concentración de complemento y el potencial de activación del complemento entre pacientes con ELA y los grupos de control se utilizan la prueba t y ANOVA de una vía. Para calcular las probabilidades de un bajo potencial de activación del complemento en el grupo de ELA en comparación con los grupos de control, los investigadores utilizan la regresión logística. Para el cálculo de los valores de corte se utilizan las curvas características de funcionamiento del receptor (ROC).

CT3: El sistema del complemento de los pacientes con ELA a lo largo del tiempo: un estudio de cohorte Como en el ensayo clínico 2. Además, se realiza un análisis de regresión de la actividad del complemento en función del tiempo desde el inicio de la ELA, el sexo, la edad, el subtipo de enfermedad y la progresión de la enfermedad. realizado.

CT4: Búsqueda de actividad del complemento en la UNM de pacientes con ELA Como en CT2. El grado de depósito del complemento y la patología muscular se describen cualitativamente y se lleva a cabo una puntuación ciega en "grado normal", "grado ligero" y "grado severo" de cambios. Esto se comparará cuantitativamente con tablas 2 x K y estadísticas no paramétricas.

Difusión de los resultados Los resultados del proyecto se publicarán en revistas internacionales revisadas por pares. Tanto los resultados positivos como los negativos serán publicados.

Perspectiva Con el establecimiento de un gran biobanco nacional de investigación de ELA, será posible realizar muchos proyectos de investigación futuros. La investigación continua en ELA es primordial para los pacientes con ELA a nivel nacional e internacional para mantener la esperanza de que se encuentre un tratamiento médico eficiente para esta enfermedad agresiva en el futuro.