Amyotrofische laterale sclerose en het aangeboren immuunsysteem

Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een progressieve, dodelijke, neurodegeneratieve ziekte die de bovenste en onderste motorneuronen aantast. Dit leidt tot ernstige spierdystrofie, hyperreflexie, fasciculaties en parese van zowel de bulbaire als de skeletmusculatuur. ALS veroorzaakt toenemende fysieke vermoeidheid en de patiënten worden al snel bedlegerig en ademhalingsmoeilijkheden. De diagnose ALS wordt gesteld volgens de El Escorial revisited. Vaak moeten klinische en neurofysiologische tests worden herhaald (1-4).

In Denemarken is de incidentie van ALS 1-2/100.000 en de prevalentie is 4-6/100.000. De gemiddelde overlevingstijd vanaf het moment van de diagnose is 3 jaar, maar met grote variatie. (5+6)

Vandaag is de pathogenese nog onbekend en kan geen enkele behandeling de progressie van ALS stoppen. Behandeling met riluzol lijkt de mediane overlevingstijd met 2 of 3 maanden te verlengen (7).

Hoogstwaarschijnlijk vereist een toekomstige medische behandeling een beter begrip van zowel de pathogenese als de pathofysiologie van ALS. Deze studie tracht dit te doen op basis van de hypothese dat ALS gedeeltelijk of volledig wordt veroorzaakt door complementactivatie.

Het complementsysteem is een complex systeem dat bestaat uit zowel eiwitten in plasma als membraangebonden eiwitten die samen het op antilichamen gebaseerde immuunsysteem complementeren. Het complementsysteem is een zichzelf in stand houdend cascadesysteem dat via verschillende wegen wordt geactiveerd. Het werkt door opsonisatie waarbij complementeiwitten zich binden aan micro-organismen om granulocyten, monocyten en macrofagen te activeren en aan te vallen. Het complementsysteem veroorzaakt ook cytolyse van micro-organismen via MAC (membrane attack complex) door activatie van de mestcellen. Het inactiveert en elimineert ook uitgebrande immuuncomplexen en voert apoptotische renovatie uit.

Een recente pilootstudie van Neuromyelitis Optica heeft aangetoond hoe het complementsysteem een ​​centrale rol speelt in de pathogenese van een ziekte die voorheen ten onrechte werd gezien als een vroeg stadium van gedissemineerde sclerose. Deze bevindingen resulteerden in een medische behandeling met anticomplement (equlizumab) met veelbelovende resultaten (8). Het is mogelijk dat gelijkaardige pathogenetische mechanismen de moleculaire basis van ALS zouden kunnen zijn.

Verschillende onderzoeksgroepen hebben geprobeerd uit te leggen hoe het immuunsysteem betrokken is bij de progressie van ALS (9-35). Verschillende studies ondersteunen de hypothese dat het complementsysteem van cruciaal belang is voor het ontstaan ​​en de progressie van ALS. (9-28)

In verschillende klinische onderzoeken met ALS-plasma is geconcludeerd dat ALS-plasma cytotoxisch is wanneer het wordt geïncubeerd met gezonde rode bloedcellen of gezond zenuwweefsel. Sommige onderzoeken geven aan dat de cytotoxiciteit wordt veroorzaakt door het complementsysteem. De resultaten kunnen echter niet consequent in alle klinische onderzoeken worden gereproduceerd. Deze proeven werden tientallen jaren geleden uitgevoerd waar de methoden voor het detecteren van complementactiviteit beperkt waren. (9-14)

Verschillende dierproeven geven aan dat ALS begint in de neuromusculaire overgangen (NMJ) en daarom eerder als een distale axonopathie moet worden beschouwd dan als een centrale neurologische ziekte, wat tegenwoordig de algemene perceptie van ALS is. (27-31)

Het doel van het project Het doel is om de kennis van de pathofysiologie van de ziekte ALS te vergroten, aangezien dit ons mogelijk dichter bij een gerichte medische behandeling kan brengen.

De projectgroep wil onderzoeken of een eerder gevonden, unieke cytotoxiciteit in het ALS-plasma kan worden teruggevonden (9-14). Als dit het geval is, dan maken de moderne methoden van vandaag het mogelijk om te detecteren of het immuunsysteem in het algemeen, en in het bijzonder het complementsysteem, deze cytotoxiciteit veroorzaakt.

De oprichting van een nationaal onderzoeksproject over ALS en het complementsysteem door een onderzoeksbiobank op te zetten met systematisch verzameld bloed en ruggenmergvocht van ALS-patiënten uit het hele land zal de mogelijkheid bieden om uit te vinden of het complementsysteem een ​​rol speelt bij het ontstaan en progressie van ALS.

Verder zal er een pilootstudie worden uitgevoerd met als doel te onderzoeken of er complementactiviteit is in de NMJ bij patiënten met ALS, zoals is aangetoond in een studie met ALS-muizen. (28)

De hypothesen

1. ALS wordt gekenmerkt door een abnormale immuunrespons met cytotoxiciteit en verhoogde complementactiviteit in plasma, wat wordt onthuld door het volgende:

   1. Plasma van patiënten met ALS vertoont een verhoogde hemolytische activiteit wanneer het wordt geïncubeerd met rode bloedcellen van gezonde proefpersonen.
   2. De complementactiviteit is verhoogd in het plasma van ALS-patiënten in vergelijking met plasma van neurologisch gezonde proefpersonen en proefpersonen met andere neurologische aandoeningen.
   3. De hemolytische activiteit in het plasma van ALS-patiënten is gecorreleerd met de complementactiviteit.
2. Het ruggenmergvocht van ALS-patiënten bevat een verhoogde complementactiviteit in vergelijking met het ruggenmergvocht van neurologisch gezonde proefpersonen en van proefpersonen met andere neurologische aandoeningen.

Patiënten, materialen en methoden:

Klinische proef 1(CT1): hemolytische activiteit en het complementsysteem in ALS-plasma

Aantal proefpersonen: 25 patiënten met ALS, 25 patiënten met andere neurologische aandoeningen, 25 gezonde vrijwilligers

Het verloop van CT1: Bij elke patiënt wordt bloed afgenomen. De rode bloedcellen en het vloeibare deel van het bloed, het plasma, worden gescheiden. De rode bloedcellen van verschillende proefpersonen worden geïncubeerd in plasma van een andere proefpersoon. Dezelfde proefkuur wordt herhaald na inactivering van het aanwezige complementsysteem zowel door warmte als door anti-complement.

Klinische proef 2(CT2): Case-control studie gericht op het in kaart brengen van het complementsysteem

Aantal proefpersonen: 100 patiënten met ALS, 100 patiënten met andere neurologische aandoeningen en 100 neurologisch gezonde patiënten

Het verloop van CT2:Bloedmonsters en hersenvocht worden voorbereid en vervolgens ingevroren in een onderzoeksbiobank. Vervolgens worden de monsters van de 3 groepen proefpersonen geanalyseerd en vergeleken met de nadruk op het complementsysteem: het complementactiveringspotentieel wordt gemeten in het biologische materiaal. Er wordt een cytokineprofiel gemaakt en de acute fase-reagentia worden in kaart gebracht door middel van multiplexassays. Verder wordt het RNA-expressieprofiel gemaakt op een celpellet die later met RNA wordt gestabiliseerd.

Klinische proef 3(CT3): Het complementsysteem van ALS-patiënten in de loop van de tijd - een cohortstudie Aantal proefpersonen:20 patiënten met ALS (subgroep van CT2)

De kuur van CT3: Om de zes maanden wordt de kuur van de CT2 herhaald. De activiteit van het complementsysteem bij elke patiënt met ALS wordt geanalyseerd naarmate de ziekte vordert.

Klinische proef 4(CT4): Zoeken naar complementactiviteit in de NMJ van ALS-patiënten

Aantal proefpersonen: 10 patiënten met ALS

Het verloop van CT4: De spierbiopten worden genomen en onmiddellijk naar de afdeling gebracht. van Pathologie bij Rigshospitalet. Vervolgens worden dunne weefsellagen gekleurd om de spiervezels en de NMJ te analyseren en de aanwezigheid van complementactiviteit te detecteren.

Uitvoering van de studie Het project bestaat uit vier klinische studies. Inclusie van de proefpersonen gebeurt samen met personeel in ALS-poliklinieken in ziekenhuizen in het hele land en proefpersonen voor de controlegroepen worden opgenomen volgens de onderstaande lijst met inclusielocaties.

Inclusie sites:

ALS polikliniek, Neurologische kliniek, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Contactpersoon: Hoofdgeneesheer Elisabeth Elmo Neurologische Kliniek, Rigshospitalet Glostrup (neurologische controlegroep, CT1+2) Contactpersoon: Professor, Hoofdgeneesheer, dr.med. Rigmor Højland Jensen Neurochirurgische Kliniek, Rigshospitalet (neurologische controlegroep, CT2) Contactpersoon: Professor, hoofdarts, dr.med. Marianne Juhler ALS polikliniek, Neurologische Afd., Bispebjerg Ziekenhuis (CT2) Contactpersoon: Hoofdarts Merete Karlsborg ALS polikliniek, Neurologische Afd., Roskilde Ziekenhuis (CT2 + 3) Contactpersoon: Hoofdgeneesheer Helle Thagesen ALS polikliniek, Neurologische Afd., Odense Universitair Ziekenhuis (CT2) Contactpersoon: Hoofdgeneesheer, dr.med. Matthias Bode ALS polikliniek, Neurologische Afdeling, Aarhus Ziekenhuis, Nørrebrogade (Klinische Proef 2) Contactpersoon: Hoofdgeneesheer, ph.d. Anette Torvin Gildhøj Privéziekenhuis, Brøndby (neurologisch gezonde controlegroep, klinische proef 2) Contactpersoon: anesthesioloog Niels Anker Pedersen

Vermogensberekeningen CT1: hemolytische activiteit en het complementsysteem in ALS-plasma De studie Overgaard et al. (18) vond een gemiddeld verschil van ongeveer 0,20 (SE 0,052 in de ALS-groep, N=20, SD 0,22) in de absorptie (415 nm en 5 uur incubatie) tussen ALS-patiënten en gezonde bioanalytici. Met α=0,05 og beta=0,20 overeenkomend met macht 0,80 moeten we 21 proefpersonen opnemen. Aangezien mogelijke uitvallers en technisch mislukte tests als tests worden beschouwd, kozen de onderzoekers ervoor om 25 proefpersonen in elke groep op te nemen. (36)

CT2: Case-control studie die het complementsysteem in kaart brengt. Het aantal proefpersonen in elke groep wordt in deze case-control studie berekend met α=0,05. De onderzoekers vergelijken het complementactiveringspotentieel van 3 groepen met hetzelfde aantal proefpersonen in elke groep. Bij gezonde proefpersonen is het complementactiveringspotentieel 100% met een normaal gebied van 50-150% en waar de prevalentie van een laag complementactiveringspotentieel (minder dan 50%) minder dan 10% is. Met power = 0,80 is berekend dat het nodig is om 100 proefpersonen in elke groep op te nemen. Hierdoor is het mogelijk om statistisch significante verschillen tussen de groepen te vinden die overeenkomen met een odds ratio van 2,3, wat zou overeenkomen met 20% van de ALS-patiënten met een laag complementactiveringspotentieel veroorzaakt door verhoogde complementactiviteit. (36)

CT3: Het complementsysteem van ALS-patiënten in de loop van de tijd - een cohortstudie Dit is een hypothesegenererende studie. Verwacht wordt dat de 20 ALS-patiënten in dit cohort een subset zullen zijn van Klinische Proef 2. Als controlegroep bij aanvang zal de neurologisch gezonde controlegroep van Klinische Proef 2 worden gebruikt.

CT4: Zoeken naar complementactiviteit in het NMJ van ALS-patiënten Er zijn geen eerdere studies die de complementactiviteit in het NMJ bij levende mensen beschrijven. Het is dus niet relevant om een ​​vermogensberekening te maken.

Gegevensverwerking CT1: Hemolytische activiteit en het complementsysteem in ALS-plasma Vergelijking van de mate van hemolyse tussen de ALS-patiënten en de controlegroepen t-test en one way ANOVA worden gebruikt. Voor het berekenen van de afkapwaarden maken de onderzoekers gebruik van Receiver Operating Characteristic (ROC)-curven.

CT2: Case-control studie die het complementsysteem in kaart brengt Vergelijking van de concentratie van complement en het complementactiveringspotentieel tussen ALS-patiënten en de controlegroepen t-test en one way ANOVA worden gebruikt. Om de kans op een laag complementactiveringspotentieel in de ALS-groep te berekenen in vergelijking met de controlegroepen, gebruiken de onderzoekers logistische regressie. Voor de berekening van de grenswaarden worden receiver operating Characteristic (ROC)-curven gebruikt.

CT3: Het complementsysteem van ALS-patiënten in de loop van de tijd - een cohortstudie Zoals in Klinische Proef 2. Verder is regressieanalyse van de complementactiviteit als een functie van de tijd sinds het begin van ALS, geslacht, leeftijd, subtype van ziekte en ziekteprogressie uitgevoerd.

CT4: Zoeken naar complementactiviteit in de NMJ van ALS-patiënten Zoals in CT2. De mate van complementafzetting en spierpathologie wordt kwalitatief beschreven en er wordt een geblindeerde score in "normale", "lichte mate" en "ernstige mate" van veranderingen uitgevoerd. Dit wordt kwantitatief vergeleken met 2 x K-tabellen en niet-parametrische statistiek.

Verspreiding van de resultaten De resultaten van het project zullen worden gepubliceerd in internationale peer-reviewed tijdschriften. Zowel positieve als negatieve bevindingen zullen worden gepubliceerd.

Perspectief Met de oprichting van een grote landelijke ALS-onderzoeksbiobank wordt het mogelijk om in de toekomst veel onderzoeksprojecten uit te voeren. Continu onderzoek naar ALS is van het grootste belang voor ALS-patiënten, zowel nationaal als internationaal, om hoop te houden op een efficiënte medische behandeling voor deze agressieve ziekte in de toekomst.