La sclérose latérale amyotrophique et le système immunitaire inné

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative progressive et mortelle qui affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs. Cela entraîne une dystrophie musculaire profonde, une hyperréflexie, des fasciculations et une parésie des muscles bulbaires et squelettiques. La SLA provoque une fatigue physique croissante et les patients deviennent rapidement alités et insuffisants respiratoires. Le diagnostic de SLA est posé selon l'Escorial revisité. Souvent, les tests cliniques et neurophysiologiques doivent être répétés (1-4).

Au Danemark, l'incidence de la SLA est de 1-2/100.000 et la prévalence est de 4-6/100.000. La durée moyenne de survie à partir du moment du diagnostic est de 3 ans mais avec une grande variance. (5+6)

Aujourd'hui, la pathogenèse est encore inconnue et aucun traitement ne peut arrêter la progression de la SLA. Le traitement par riluzole semble prolonger la durée médiane de survie de 2 ou 3 mois (7).

Très probablement, un futur traitement médical nécessite une meilleure compréhension de la pathogenèse ainsi que de la physiopathologie de la SLA. Cette présente étude vise à le faire en se basant sur l'hypothèse que la SLA est partiellement ou totalement causée par l'activation du complément.

Le système du complément est un système complexe composé de protéines dans le plasma ainsi que de protéines liées à la membrane qui, ensemble, complètent le système immunitaire à base d'anticorps. Le système du complément est un système en cascade auto-entretenu qui est activé par différentes voies. Il fonctionne par opsonisation où les protéines du complément se lient aux micro-organismes pour activer et cibler les granulocytes, les monocytes et les macrophages. Le système du complément provoque également la cytolyse des microorganismes via le MAC (complexe d'attaque membranaire) par activation des mastocytes. Il inactive et élimine également les complexes immuns épuisés et effectue une rénovation apoptotique.

Une étude pilote récente sur la neuromyélite optique a montré comment le système du complément joue un rôle central dans la pathogenèse d'une maladie qui était auparavant perçue à tort comme un stade précoce de la sclérose disséminée. Ces découvertes ont abouti à un traitement médical par anticomplément (equlizumab) avec des résultats prometteurs (8). Il est possible que des mécanismes pathogéniques similaires soient à la base moléculaire de la SLA.

Différents groupes de recherche ont tenté d'éclairer la façon dont le système immunitaire est impliqué dans la progression de la SLA (9-35). Plusieurs études soutiennent l'hypothèse que le système du complément est d'une importance cruciale pour l'apparition et la progression de la SLA. (9-28)

Dans plusieurs essais cliniques avec du plasma ALS, il a été conclu que le plasma ALS est cytotoxique lorsqu'il est incubé avec des globules rouges sains ou du tissu nerveux sain. Certaines recherches indiquent que la cytotoxicité est causée par le système du complément. Les résultats ne peuvent cependant pas être reproduits par conséquent dans tous les essais cliniques. Ces essais ont été menés il y a des décennies, alors que les méthodes de détection de l'activité du complément étaient limitées. (9-14)

Plusieurs essais sur des animaux indiquent que la SLA commence dans les jonctions neuromusculaires (NMJ) et devrait donc être considérée comme une axonopathie distale plutôt qu'une maladie neurologique centrale, ce qui est aujourd'hui la perception générale de la SLA. (27-31)

L'objectif du projet L'objectif est d'approfondir les connaissances sur la physiopathologie de la maladie SLA car cela pourrait éventuellement nous rapprocher d'un traitement médical ciblé.

Le groupe de projet veut étudier si une cytotoxicité unique précédemment trouvée dans le plasma de la SLA peut être récupérée (9-14). Si tel est le cas, alors les méthodes modernes d'aujourd'hui permettent de détecter si le système immunitaire en général, et en particulier le système du complément, est à l'origine de cette cytotoxicité.

La mise en place d'un projet de recherche national sur la SLA et le système du complément en créant une biobanque de recherche avec du sang et du liquide céphalo-rachidien systématiquement collectés auprès de patients SLA de tout le pays permettra de déterminer si le système du complément joue un rôle dans l'apparition et la progression de la SLA.

En outre, une étude pilote sera menée dans le but d'étudier s'il existe une activité du complément dans le NMJ chez les patients atteints de SLA, comme cela a été démontré dans une étude sur des souris SLA. (28)

Les hypothèses

1. La SLA se caractérise par une réponse immunitaire anormale avec cytotoxicité et augmentation de l'activité du complément dans le plasma qui se révèle par les éléments suivants :

   1. Le plasma de patients atteints de SLA montre une activité hémolytique accrue lorsqu'il est incubé avec des globules rouges de sujets sains.
   2. L'activité du complément est augmentée dans le plasma des patients SLA par rapport au plasma de sujets neurologiquement sains et de sujets atteints d'autres maladies neurologiques.
   3. L'activité hémolytique dans le plasma des patients SLA est corrélée à l'activité du complément.
2. Le liquide céphalo-rachidien des patients atteints de SLA contient une activité complémentaire accrue par rapport au liquide céphalo-rachidien de sujets neurologiquement sains et de sujets atteints d'autres maladies neurologiques.

Patients, matériel et méthodes :

Essai clinique 1(CT1) : Activité hémolytique et système du complément dans le plasma SLA

Nombre de sujets : 25 patients atteints de SLA, 25 patients atteints d'une autre maladie neurologique, 25 volontaires sains

Déroulement du CT1 : Un prélèvement sanguin est effectué sur chaque patient. Les globules rouges et la partie liquide du sang, le plasma, sont séparés. Les globules rouges de différents sujets sont incubés dans le plasma d'un autre sujet. Le même cycle d'essai est répété après inactivation du présent système du complément à la fois par la chaleur et par l'anti-complément.

Essai clinique 2(CT2) : étude cas-témoins visant à cartographier le système du complément

Nombre de sujets : 100 patients atteints de SLA, 100 patients atteints d'une autre maladie neurologique et 100 patients neurologiquement sains

Le parcours du CT2 : Des échantillons de sang et de liquide céphalo-rachidien sont préparés puis congelés dans une biobanque de recherche. Ensuite, les échantillons des 3 groupes de sujets sont analysés et comparés en se concentrant sur le système du complément : Le potentiel d'activation du complément est mesuré dans le matériel biologique. Un profil des cytokines est réalisé ainsi qu'une cartographie des réactifs de la phase aiguë par dosages multiplex. De plus, le profil d'expression de l'ARN est réalisé sur un culot cellulaire stabilisé ultérieurement avec de l'ARN.

Essai clinique 3(CT3) : Le système du complément des patients SLA au fil du temps - une étude de cohorte Nombre de sujets : 20 patients atteints de SLA (sous-ensemble de CT2)

Le cours du CT3 : Tous les six mois le cours du CT2 est répété. L'activité du système du complément chez chaque patient atteint de SLA est analysée au fur et à mesure de la progression de la maladie.

Essai clinique 4(CT4) : Recherche de l'activité du complément dans le NMJ des patients SLA

Nombre de sujets : 10 patients atteints de SLA

Déroulement du CT4 : Les biopsies musculaires sont réalisées et immédiatement apportées au Dep. de pathologie au Rigshospitalet. Ensuite, de fines couches de tissu sont colorées afin d'analyser les fibres musculaires et le NMJ ainsi que de détecter la présence de l'activité du complément.

Conduite de l'étude Le projet consiste en quatre essais cliniques. L'inclusion des sujets se fait avec le personnel des cliniques externes SLA dans les hôpitaux de tout le pays et les sujets des groupes témoins sont inclus selon la liste des sites d'inclusion ci-dessous.

Sites d'insertion :

Clinique externe SLA, Clinique neurologique, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Contact : Médecin-chef Elisabeth Elmo Clinique neurologique, Rigshospitalet Glostrup (groupe de contrôle neurologique, CT1+2) Contact : Professeur, Médecin-chef, dr.med. Clinique neurochirurgicale Rigmor Højland Jensen, Rigshospitalet (groupe de contrôle neurologique, CT2) Contact : Professeur, médecin-chef, dr.med. Marianne Juhler Clinique externe SLA, Service neurologique, Hôpital Bispebjerg (CT2) Contact : Médecin-chef Merete Karlsborg Clinique externe SLA, Service neurologique, Hôpital Roskilde (CT2 + 3) Contact : Médecin-chef Helle Thagesen Clinique externe SLA, Service neurologique, Hôpital universitaire d'Odense (CT2) Contact : Médecin-chef, dr.med. Clinique ambulatoire Matthias Bode ALS, service neurologique, hôpital d'Aarhus, Nørrebrogade (essai clinique 2) Contact : médecin-chef, ph.d. Hôpital privé Anette Torvin Gildhøj, Brøndby (groupe témoin neurologiquement sain, essai clinique 2) Contact : anesthésiste Niels Anker Pedersen

Calculs de puissance CT1 : Activité hémolytique et système du complément dans le plasma SLA L'étude Overgaard et al. (18) ont trouvé une différence moyenne d'environ 0,20 (SE 0,052 dans le groupe SLA, N = 20, SD 0,22) dans l'absorbance (415 nm et 5 heures d'incubation) entre les patients SLA et les bioanalystes sains. Avec α=0,05 og beta=0,20 correspondant à la puissance 0,80 nous devons inclure 21 sujets. Comme les abandons possibles et les échecs techniques sont considérés comme des tests, les enquêteurs choisissent d'inclure 25 sujets dans chaque groupe. (36)

CT2 : Étude cas-témoin cartographiant le système du complément Le nombre de sujets dans chaque groupe est dans cette étude cas-témoin calculé avec α=0,05 Les chercheurs comparent le potentiel d'activation du complément de 3 groupes avec le même nombre de sujets dans chacun. Chez les sujets sains, le potentiel d'activation du complément est de 100 % avec une aire normale comprise entre 50 et 150 % et où la prévalence d'un faible potentiel d'activation du complément (moins de 50 %) est inférieure à 10 %. Avec une puissance =0,80 il est calculé qu'il faut inclure 100 sujets dans chaque groupe. Ainsi, il est possible de trouver des différences statistiquement significatives entre les groupes correspondant à un rapport de cotes de 2,3, ce qui correspondrait à 20 % des patients SLA ayant un faible potentiel d'activation du complément causé par une activité accrue du complément. (36)

CT3 : Le système du complément des patients SLA au fil du temps - une étude de cohorte Il s'agit d'une étude génératrice d'hypothèses. Il est prévu que les 20 patients SLA inclus dans cette cohorte seront un sous-ensemble de l'essai clinique 2. Comme groupe témoin au départ, le groupe témoin neurologiquement sain de l'essai clinique 2 sera utilisé.

CT4 : Recherche de l'activité du complément dans le NMJ des patients SLA Il n'existe aucune étude antérieure décrivant l'activité du complément dans le NMJ chez l'homme vivant. Il n'est donc pas pertinent de faire un calcul de puissance.

Traitement des données CT1 : Activité hémolytique et système du complément dans le plasma SLA Comparaison du degré d'hémolyse entre les patients SLA et les groupes témoins Le test t et l'ANOVA à un facteur sont utilisés. Pour calculer les valeurs seuils, les chercheurs utilisent des courbes de caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC).

CT2 : Étude cas-témoin cartographiant le système du complément Comparant la concentration de complément et le potentiel d'activation du complément entre les patients SLA et les groupes témoins Le test t et l'ANOVA à un facteur sont utilisés. Afin de calculer les probabilités d'un faible potentiel d'activation du complément dans le groupe SLA par rapport aux groupes témoins, les chercheurs utilisent la régression logistique. Pour le calcul des valeurs seuils, des courbes de caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC) sont utilisées.

CT3: Le système du complément des patients SLA au fil du temps - une étude de cohorte Comme dans l'essai clinique 2. De plus, une analyse de régression de l'activité du complément en fonction du temps depuis le début de la SLA, du sexe, de l'âge, du sous-type de maladie et de la progression de la maladie est menées.

CT4 : Recherche de l'activité du complément dans le NMJ des patients SLA Comme dans CT2. Le degré de dépôt de complément et de pathologie musculaire est décrit qualitativement et une notation en aveugle des changements « normaux », « degré léger » et « degré sévère » est effectuée. Ceci sera comparé quantitativement avec des tableaux 2 x K et des statistiques non paramétriques.

Diffusion des résultats Les résultats du projet seront publiés dans des revues internationales à comité de lecture. Les résultats positifs et négatifs seront publiés.

Perspective Avec l'établissement d'une grande biobanque nationale de recherche sur la SLA, il sera possible de mener de nombreux projets de recherche futurs. La recherche continue sur la SLA est primordiale pour les patients atteints de SLA à l'échelle nationale et internationale afin de maintenir l'espoir qu'un traitement médical efficace pour cette maladie agressive soit trouvé à l'avenir.