25-OH D-vitamiinin täydennyksen immunomoduloivat vaikutukset (SCLERODERMA)

Tutkimus toteutetaan paikallisen tutkimus- ja eettisen toimikunnan ennakkoluvalla. Mukana ovat potilaat, jotka ovat oikeutettuja terveydenhuoltopalveluihimme ja täyttävät seulontakriteerit.

Tietokannassamme olevat sklerodermapotilaat kutsutaan osallistumaan tutkimukseen puhelimitse. Potilaat, jotka täyttävät seulontakriteerit ja suostuvat osallistumaan tutkimukseen, saavat päivämäärän.

Haastattelupäivänä heille annetaan tietoinen suostumuslomake. Kun se on allekirjoitettu, heitä pyydetään täyttämään kliiniset tiedot ja seeruminäytteet kerättiin biokemiallisia määrityksiä varten, mukaan lukien D-vitamiinin tila.

Kun potilaat ovat suorittaneet alustavat arvioinnit, uusi käynti järjestetään kahden viikon kuluttua. Potilaat, joilla on D-hypovitaminoositulos, jaetaan satunnaisesti toiseen kahdesta ryhmästä: ryhmä 1. D3-vitamiinilisä ja ryhmä 2. Ruokavalio-suositukset. Kaksi ryhmää sai ohjeet noudattaa ruokavaliosuosituksia tai saada D3-vitamiinilisää ja suorittaa lääketieteelliset mittaukset. Lisäksi tutkijoiden joukossa oli SSc-potilaita, joilla oli D-vitamiinin riittävyys ja toinen terveillä luovuttajilla.

Toisella käynnillä (neljä viikkoa myöhemmin) kirjataan kliiniset tiedot ja seuraavat parametrit: kalsium, fosfori, lisäkilpirauhashormoni quimioluniscencialla 25-hydroksi-D-vitamiini seerumin tila ELISA:lla, solunsisäinen sytokiini (IL-2, INF-γ, IL- 4 ja IL-10) tuotanto Th1-, Th2- ja Treg-lymfosyyteistä virtaussytometrialla.

Ryhmä 1. Päivittäiset suun kautta annettavat 5 000 UI D3-vitamiiniannokset 4 viikon ajan.

Ryhmä 2. Ravitsemussuositukset D-vitamiinin normaalin päivittäisen saannin suositusten mukaisesti 4 viikon ajan.

Ja lisäksi tutkijat ottavat vertailijoiksi mukaan SSc-ryhmän, jolla on D-vitamiinin riittävyys, sekä terveitä luovuttajia.

Jokaiselle ryhmälle annetaan kirjalliset ohjeet huumeiden käytöstä. Lisäravinteiden päätyttyä järjestetään uusi käynti, jossa tarkistetaan hoitomyöntyvyys (jäljellä olevat kapselit lasketaan) ja potilaat suorittavat toisen kliinisen arvioinnin ja kalsiumin, fosforin, lisäkilpirauhashormonin quimioluniscencia 25-hydroksi-D-vitamiini seerumin tilan ELISA:lla, solunsisäinen sytokiinien (IL-2, INF-y, IL-4 ja IL-10) tuotanto Th1-, Th2- ja Treg-lymfosyyteistä virtaussytometrialla. Lopuksi suoritetaan tilastollinen analyysi.

Osallistujia pyydetään myös täyttämään lomake, jossa kirjataan oireet ja mahdolliset haittatapahtumat.

Lymfosyyttien erotus Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC:t) eristettiin tiheysgradienttisentrifugoinnilla (Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich) juuri otetusta laskimoverestä. Solunsisäistä sytokiinituotantoa PBMC-soluissa (1 x 106 solua/putki) stimuloitiin 37 ºC:ssa 4 tunnin ajan Streptomyces-konglobateista peräisin olevalla Ionomicyn-kalsiumsuolalla (1 µg/1 x 106 solua, Sigma-Aldrich), Brefeldin A:lla (10 µg/1 x 106 kemiallinen yritys, Cayman Chemical Company). forbol-12-myristaatti-13-asetaatti (PMA-25ng/1 x 106 solua, Sigma-Aldrich).

T-solujen solupinta ja solunsisäinen värjäys PBMC:t suspendoitiin uudelleen (PBS) fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) ja värjättiin monoklonaalisilla konjugoiduilla vasta-aineilla joko fluoreseiini-isotiosynaatilla (FITC), perill-proteiinikompleksilla (FITC) fykoerytriini (PE) tai allofykosyaniini (APC) ja suunnattu CD69:lle (L/78), CD25:lle, CD3:lle, CD4:lle (BD PharmigenTM ja BD Bioscience) 20 minuutin ajan. IL-4:n (BD PharmigenTM), IL-2:n, INF-y:n (BD Fast Immune), FoxP3:n (Affymetrix) ja IL10:n (eBioscinence) solunsisäistä värjäystä varten solut kiinnitettiin aiemmin käyttämällä kiinnityspuskuria (BioLegend) 20 minuutin ajan huoneessa. lämpötilassa, jota seurasi pesuvaihe permeabilisaatiopuskurilla (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) valmistajan ohjeiden mukaisesti, sitten värjäyssoluja inkuboitiin monoklonaalisen vasta-aineen kanssa 20 minuuttia huoneenlämpötilassa ja suspendoitiin uudelleen PBS-puskuriin. Th1-, Th2- ja Treg-alapopulaatioiden arviointi virtaussytometrialla määritettiin IL-2+:n ja INF-y+:n prosenttiosuuksina Th1-lymfosyyteille, IL-4+:lle Th2:lle ja CD25+FoxP3+IL-10+:lle Tregille CD3:ssa. +CD4+ portti. Tiedot kerättiin ja analysoitiin käyttämällä neliparametrista virtaussytometriä FACS Calibur käyttäen ProCellQuest-ohjelmistoa (Beckman Coulter; BD Biosciences) ja Flowing Softwarea (versio 2.5.1). Cell Imaging Core .