Effetti immunomodulanti dell'integrazione con 25-OH vitamina D (SCLERODERMA)

Lo studio sarà effettuato previa autorizzazione del Comitato Etico e della Ricerca Locale. Saranno inclusi i pazienti che hanno diritto ai nostri servizi sanitari e che rispettano i criteri di screening.

I pazienti con sclerodermia inclusi nel nostro database saranno invitati a partecipare allo studio tramite una telefonata. Ai pazienti che soddisfano i criteri di screening e che accettano di partecipare allo studio verrà data una data.

Il giorno del colloquio verrà consegnato loro il modulo di consenso informato. Una volta firmato, verrà chiesto loro di completare il registro clinico e verranno raccolti campioni di siero per le determinazioni biochimiche, incluso lo stato della vitamina D.

Una volta che i pazienti avranno completato le valutazioni iniziali, verrà programmata un'altra visita due settimane dopo. I pazienti con risultato di ipovitaminosi D verranno assegnati in modo casuale a uno dei due gruppi: Gruppo 1. Integrazione di vitamina D3 e Gruppo 2. Raccomandazioni dietetiche. Due gruppi hanno ricevuto istruzioni per seguire le raccomandazioni dietetiche o per ricevere l'integrazione di vitamina D3 e completare le misurazioni mediche. Inoltre, i ricercatori hanno incluso pazienti con SSc con sufficienza di vitamina D e un altro con donatori sani.

Alla seconda visita (quattro settimane dopo), verranno registrati i dati clinici e i seguenti parametri: calcio, fosforo, ormone paratiroideo mediante quimioluniscencia stato sierico della 25-idrossivitamina D mediante ELISA, citochine intracellulari (IL-2, INF-γ, IL- 4 e IL-10) dai linfociti Th1, Th2 e Treg mediante citometria a flusso.

Gruppo 1. Dosaggi orali giornalieri di 5.000 UI di vitamina D3 per 4 settimane.

Gruppo 2. Raccomandazioni dietetiche secondo le raccomandazioni per la normale assunzione giornaliera di vitamina D negli alimenti per 4 settimane.

Inoltre, i ricercatori stanno includendo il gruppo SSc con sufficienza di vitamina D e donatori sani entrambi come comparatori.

Ad ogni gruppo verranno fornite istruzioni scritte sull'uso di sostanze stupefacenti. Al termine delle integrazioni sarà programmata un'altra visita per verificare la compliance al trattamento (verranno conteggiate le capsule rimanenti) e i pazienti completeranno le seconde valutazioni cliniche e calcio, fosforo, ormone paratiroideo mediante quimioluniscencia 25-idrossivitamina D sierica mediante ELISA, intracellulare produzione di citochine (IL-2, INF-γ, IL-4 e IL-10) da linfociti Th1, Th2 e Treg mediante citometria a flusso. Al termine verrà effettuata l'analisi statistica.

Ai partecipanti verrà inoltre chiesto di compilare un modulo registrando sintomi e potenziali eventi avversi.

Separazione dei linfociti Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità (Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich) da sangue venoso appena prelevato. La produzione intracellulare di citochine nelle PBMC (1x106 cellule/provetta) è stata stimolata a 37ºC per 4 ore con ionomicina sale di calcio da Streptomyces conglobates (1μg/1x106 cellule, Sigma-Aldrich), Brefeldin A (10μg/1x106 cellule, azienda chimica Cayman) e forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA-25ng/1 x106 celle, Sigma-Aldrich).

Superficie cellulare e colorazione intracellulare delle cellule T I PBMC sono stati risospesi con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) e colorati con anticorpi coniugati monoclonali con isotiocinato di fluoresceina (FITC), complesso proteico della clorofilla peridinina (PerCP), fico-eritrina (PE) o alloficocianina (APC) e diretto a CD69 (L/78), CD25, CD3, CD4 (BD PharmigenTM e BD Bioscience) per 20 min. Per la colorazione intracellulare di IL-4 (BD PharmigenTM), IL-2, INF-γ (BD Fast Immune), FoxP3 (Affymetrix) e IL10 (eBioscinence), le cellule sono state precedentemente fissate utilizzando il tampone di fissazione (BioLegend) per 20 minuti in camera temperatura seguita da una fase di lavaggio con tampone di permeabilizzazione (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) secondo i protocolli del produttore, quindi le cellule coloranti sono state incubate con anticorpo monoclonale per 20 minuti a temperatura ambiente e risospese in tampone PBS. La valutazione delle sottopopolazioni Th1, Th2 e Treg mediante citometria a flusso è stata determinata come espressione percentuale di IL-2+ e INF-γ+ per i linfociti Th1, IL-4+ per Th2 e CD25+FoxP3+IL-10+ per Treg all'interno del CD3 +CD4+ cancello. I dati sono stati acquisiti e analizzati utilizzando un citometro a flusso a quattro parametri FACS Calibur utilizzando il software ProCellQuest (Beckman Coulter; BD Biosciences) e Flowing Software (versione 2.5.1) Nucleo di imaging cellulare.