Immunmodulerende virkninger af tilskud med 25-OH D-vitamin (SCLERODERMA)

Undersøgelsen vil blive udført med forudgående tilladelse fra den lokale forsknings- og etikkomité. Patienter, der har ret til vores sundhedsydelser og overholder screeningskriterier, vil blive inkluderet.

Patienter med sklerodermi inkluderet i vores database vil blive inviteret til at deltage i undersøgelsen via et telefonopkald. Patienter, der overholder screeningskriterierne og accepterer at deltage i undersøgelsen, vil få en dato.

På dagen for samtalen vil de få udleveret den informerede samtykkeerklæring. Når den er blevet underskrevet, vil de blive bedt om at udfylde den kliniske registrering, og serumprøver blev indsamlet til biokemiske bestemmelser, herunder D-vitaminstatus.

Når patienterne har gennemført de indledende evalueringer, vil der blive planlagt endnu et besøg to uger senere. Patienter med hypovitaminose D-resultat vil blive tilfældigt inddelt i en af ​​to grupper: Gruppe 1. Vitamin D3-tilskud og Gruppe 2. Kostanbefalinger. To grupper fik instruktioner om at følge kostanbefalinger eller at modtage D3-vitamintilskud og gennemføre de medicinske målinger. Derudover inkluderede efterforskerne SSc-patienter med D-vitamintilstrækkelighed og en anden med raske donorer.

Ved det andet besøg (fire uger senere) vil kliniske data og følgende parametre blive registreret: calcium, phosforus, parathyreoideahormon ved quimioluniscencia 25-hydroxyvitamin D serumstatus ved ELISA, intracellulært cytokin (IL-2, INF-γ, IL- 4 og IL-10) produktion fra Th1-, Th2- og Treg-lymfocytter ved flowcytometri.

Gruppe 1. Daglige orale doser på 5.000 UI vitamin D3 i løbet af 4 uger.

Gruppe 2. Kostanbefalinger i henhold til anbefalingerne for normalt dagligt indtag af D-vitamin i maden i løbet af 4 uger.

Og derudover inkluderer efterforskerne SSc-gruppe med D-vitamintilstrækkelighed og sunde donorer, begge som komparatorer.

Hver gruppe vil få skriftlige instruktioner vedrørende stofbrug. Ved afslutningen af ​​kosttilskuddene vil der blive planlagt endnu et besøg for at kontrollere, om behandlingen overholdes (resterende kapsler vil blive talt), og patienterne vil fuldføre den anden kliniske evaluering og calcium, phosfor, parathyroidhormon ved quimioluniscencia 25-hydroxyvitamin D serumstatus ved ELISA, intracellulært cytokin (IL-2, INF-y, IL-4 og IL-10) produktion fra Th1, Th2 og Treg lymfocytter ved flowcytometri. Til sidst vil den statistiske analyse blive udført.

Deltagerne vil også blive bedt om at udfylde en formular, der registrerer symptomer og potentielle bivirkninger.

Lymfocytseparation Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) blev isoleret ved tæthedsgradientcentrifugering (Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich) fra frisk udtaget venøst ​​blod. Intracellulær cytokinproduktion i PBMC'er (1x106 celler/rør) blev stimuleret ved 37ºC i 4 timer med Ionomicyn calciumsalt fra Streptomyces conglobates (1μg/1 x106 celler, Sigma-Aldrich), Brefeldin A (10μg/1 x106 kemiske virksomheder) og Cayman-celler phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA-25ng/1 x106 celler, Sigma-Aldrich).

Celleoverflade og intracellulær farvning af T-celler PBMC'er blev resuspenderet med (PBS) fosfatbufret saltvand (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) og farvet med monoklonale konjugerede antistoffer med enten fluorescein isothiocynat (FITC), peridinin chlorophyll, proteinkompleks (PCP) phyco-erythrin (PE) eller allophycocyanin (APC) og rettet til CD69 (L/78), CD25, CD3, CD4 (BD PharmigenTM og BD Bioscience) i 20 min. Til intracellulær farvning af IL-4 (BD PharmigenTM), IL-2, INF-γ (BD Fast Immune), FoxP3 (Affymetrix) og IL10 (eBioscinens), blev celler tidligere fikseret ved hjælp af fikseringsbuffer (BioLegend) i 20 minutter i værelset temperatur efterfulgt af et vasketrin med permeabiliseringsbuffer (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) i henhold til producentens protokoller, derefter blev farvning af celler inkuberet med monoklonalt antistof i 20 minutter ved stuetemperatur og resuspenderet i PBS-buffer. Evaluering af Th1-, Th2- og Treg-subpopulationer ved flowcytometri blev bestemt som IL-2+- og INF-y+-procenter ekspression for Th1-lymfocytter, IL-4+ for Th2 og CD25+FoxP3+IL-10+ for Treg inden for CD3 +CD4+ port. Data blev indsamlet og analyseret ved hjælp af et fire-parameter flowcytometer FACS Calibur ved hjælp af ProCellQuest-software (Beckman Coulter; BD Biosciences) og flow-software (version 2.5.1) Cellebilleddannelseskerne.