Immunomodulujące efekty suplementacji 25-OH witaminą D (SCLERODERMA)

Badanie zostanie przeprowadzone za uprzednią zgodą Lokalnej Komisji ds. Badań i Etyki. Pacjenci uprawnieni do naszych usług zdrowotnych i spełniający kryteria przesiewowe zostaną uwzględnieni.

Chorzy na twardzinę znajdującą się w naszej bazie zostaną zaproszeni do udziału w badaniu telefonicznie. Pacjenci spełniający kryteria przesiewowe i wyrażający zgodę na udział w badaniu otrzymają termin.

W dniu wywiadu otrzymają formularz świadomej zgody. Po jej podpisaniu zostaną poproszeni o wypełnienie rejestru klinicznego i pobranie próbek surowicy do oznaczeń biochemicznych, w tym poziomu witaminy D.

Gdy pacjenci zakończą wstępną ocenę, kolejna wizyta zostanie zaplanowana dwa tygodnie później. Pacjenci z wynikiem hipowitaminozy D zostaną losowo przydzieleni do jednej z dwóch grup: Grupa 1. Suplementacja witaminy D3 oraz Grupa 2. Zalecenia dietetyczne. Dwie grupy otrzymały instrukcje przestrzegania zaleceń dietetycznych lub przyjmowania suplementacji witaminy D3 i wykonania pomiarów medycznych. Dodatkowo badacze obejmowali pacjentów z SSc z wystarczającym poziomem witaminy D oraz jednego ze zdrowymi dawcami.

Podczas drugiej wizyty (po czterech tygodniach) zostaną zarejestrowane dane kliniczne i następujące parametry: wapń, fosfor, parathormon metodą quimioluniscencia 25-hydroksywitamina D stan surowicy metodą ELISA, cytokiny wewnątrzkomórkowe (IL-2, INF-γ, IL- 4 i IL-10) z limfocytów Th1, Th2 i Treg metodą cytometrii przepływowej.

Grupa 1. Dzienne doustne dawki 5000 UI witaminy D3 przez 4 tygodnie.

Grupa 2. Zalecenia dietetyczne według zaleceń dotyczących prawidłowego dziennego spożycia witaminy D z pożywieniem w ciągu 4 tygodni.

Dodatkowo, badacze włączają grupę SSc z wystarczającym poziomem witaminy D i zdrowych dawców jako komparatorów.

Każda grupa otrzyma pisemne instrukcje dotyczące używania narkotyków. Pod koniec suplementacji zaplanowana zostanie kolejna wizyta w celu sprawdzenia zgodności leczenia (pozostałe kapsułki zostaną policzone), a pacjenci przejdą drugą ocenę kliniczną oraz stan wapnia, fosforu, parathormonu za pomocą quimioluniscencia 25-hydroksywitaminy D w surowicy za pomocą testu ELISA, wewnątrzkomórkowego produkcja cytokin (IL-2, INF-γ, IL-4 i IL-10) z limfocytów Th1, Th2 i Treg metodą cytometrii przepływowej. Na koniec zostanie przeprowadzona analiza statystyczna.

Uczestnicy zostaną również poproszeni o wypełnienie formularza rejestrującego objawy i potencjalne zdarzenia niepożądane.

Separacja limfocytów Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) izolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości (Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich) ze świeżo pobranej krwi żylnej. Wewnątrzkomórkowe wytwarzanie cytokin w PBMC (1x106 komórek/probówkę) stymulowano w temperaturze 37ºC przez 4h solą wapniową jonomicyny z konglobatów Streptomyces (1μg/1x106 komórek, Sigma-Aldrich), Brefeldyną A (10μg/1x106 komórek, Cayman Chemical Company) i 12-mirystynian-13-octan forbolu (PMA-25ng/1 x 106 komórek, Sigma-Aldrich).

Barwienie powierzchni komórek i wewnątrzkomórkowe limfocytów T PBMC ponownie zawieszono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) i barwiono skoniugowanymi przeciwciałami monoklonalnymi z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), perydyniną i kompleksem białek chlorofilowych (PerCP), fikoerytryny (PE) lub allofikocyjaniny (APC) i kierowane na CD69 (L/78), CD25, CD3, CD4 (BD PharmigenTM i BD Bioscience) przez 20 min. Do wewnątrzkomórkowego barwienia IL-4 (BD PharmigenTM), IL-2, INF-γ (BD Fast Immune), FoxP3 (Affymetrix) i IL10 (eBioscinence), komórki uprzednio utrwalano za pomocą buforu utrwalającego (BioLegend) przez 20 minut w temperaturze pokojowej temperaturze, a następnie etap przemywania buforem permeabilizującym (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) zgodnie z protokołami producenta, następnie barwiące komórki inkubowano z przeciwciałem monoklonalnym przez 20 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawieszono w buforze PBS. Ocenę subpopulacji Th1, Th2 i Treg za pomocą cytometrii przepływowej określono jako procentową ekspresję IL-2+ i INF-γ+ dla limfocytów Th1, IL-4+ dla Th2 i CD25+FoxP3+IL-10+ dla Treg w obrębie CD3 Bramka +CD4+. Dane zbierano i analizowano za pomocą czteroparametrowego cytometru przepływowego FACS Calibur przy użyciu oprogramowania ProCellQuest (Beckman Coulter; BD Biosciences) i Flowing Software (wersja 2.5.1) Rdzeń obrazowania komórek.