Efectos inmunomoduladores de la suplementación con 25-OH vitamina D (SCLERODERMA)

El estudio se realizará con la autorización previa del Comité Local de Investigación y Ética. Se incluirán pacientes con derecho a nuestros servicios sanitarios y que cumplan criterios de cribado.

Los pacientes con esclerodermia incluidos en nuestra base de datos serán invitados a participar en el estudio a través de una llamada telefónica. A los pacientes que cumplan con los criterios de selección y acepten participar en el estudio se les dará una fecha.

El día de la entrevista se les entregará el formulario de consentimiento informado. Una vez firmada, se les pedirá que completen el registro clínico y se recolectarán muestras de suero para las determinaciones bioquímicas, incluido el estado de vitamina D.

Una vez que los pacientes hayan completado las evaluaciones iniciales, se programará otra visita dos semanas después. Los pacientes con resultado de hipovitaminosis D serán asignados aleatoriamente a uno de dos grupos: Grupo 1. Suplementos de vitamina D3 y Grupo 2. Recomendaciones dietéticas. Dos grupos recibieron instrucciones para seguir las recomendaciones dietéticas o recibir suplementos de vitamina D3 y completar las mediciones médicas. Además, los investigadores incluyeron pacientes con SSc con suficiencia de vitamina D y otro con donantes sanos.

En la segunda visita (cuatro semanas después), se registrarán los datos clínicos y los siguientes parámetros: calcio, fósforo, hormona paratiroidea por quimioluniscencia 25-hidroxivitamina D, estado sérico por ELISA, citocina intracelular (IL-2, INF-γ, IL- 4 e IL-10) a partir de linfocitos Th1, Th2 y Treg por citometría de flujo.

Grupo 1. Dosis orales diarias de 5.000 UI de vitamina D3 durante 4 semanas.

Grupo 2. Recomendaciones dietéticas según las recomendaciones de ingesta diaria normal de vitamina D en los alimentos durante 4 semanas.

Y además, los investigadores están incluyendo el grupo SSc con suficiencia de vitamina D y donantes sanos como comparadores.

Cada grupo recibirá instrucciones escritas sobre el uso de drogas. Al final de las suplementaciones se programará otra visita para verificar el cumplimiento del tratamiento (se contarán las cápsulas restantes) y los pacientes completarán las segundas evaluaciones clínicas y calcio, fósforo, hormona paratiroidea por quimioluniscencia 25-hidroxivitamina D estado sérico por ELISA, intracelular producción de citocinas (IL-2, INF-γ, IL-4 e IL-10) a partir de linfocitos Th1, Th2 y Treg mediante citometría de flujo. Al final se realizará el análisis estadístico.

También se les pedirá a los participantes que completen un formulario que registre los síntomas y los posibles eventos adversos.

Separación de linfocitos Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad (Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich) a partir de sangre venosa recién extraída. La producción de citocinas intracelulares en PBMC (1x106 células/tubo) se estimuló a 37ºC durante 4 h con sal de calcio de Ionomicyn de Streptomyces conglobates (1 μg/ 1 x106 células, Sigma-Aldrich), Brefeldina A (10 μg/ 1 x106 células, Cayman Chemical Company) y forbol-12-miristato-13-acetato (PMA-25ng/1 x106 células, Sigma-Aldrich).

Superficie celular y tinción intracelular de células T Las PBMC se resuspendieron con (PBS) solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) y se tiñeron con anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC), complejo de proteína de clorofila de peridinina (PerCP), ficoeritrina (PE) o aloficocianina (APC) y dirigida a CD69 (L/78), CD25, CD3, CD4 (BD PharmigenTM y BD Bioscience) durante 20 min. Para la tinción intracelular de IL-4 (BD PharmigenTM), IL-2, INF-γ (BD Fast Immune), FoxP3 (Affymetrix) e IL10 (eBioscinence), las células se fijaron previamente con un tampón de fijación (BioLegend) durante 20 min a temperatura ambiente. temperatura seguida de un paso de lavado con tampón de permeabilización (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) de acuerdo con los protocolos del fabricante, luego las células teñidas se incubaron con anticuerpo monoclonal durante 20 min a temperatura ambiente y se resuspendieron en tampón PBS. La evaluación de las subpoblaciones Th1, Th2 y Treg por citometría de flujo se determinó como porcentajes de expresión de IL-2+ e INF-γ+ para linfocitos Th1, IL-4+ para Th2 y CD25+FoxP3+IL-10+ para Treg dentro del grupo CD3. puerta +CD4+. Los datos se adquirieron y analizaron usando un citómetro de flujo de cuatro parámetros FACS Calibur usando el software ProCellQuest (Beckman Coulter; BD Biosciences) y Flowing Software (Versión 2.5.1) Núcleo de imágenes celulares.