Imunomodulační účinky suplementace 25-OH vitaminem D (SCLERODERMA)

Studie bude provedena s předchozím souhlasem místního výboru pro výzkum a etiku. Budou zahrnuti pacienti, kteří mají nárok na naše zdravotnické služby a splňují kritéria screeningu.

Pacienti se sklerodermií zařazení do naší databáze budou vyzváni k účasti ve studii prostřednictvím telefonického hovoru. Pacientům, kteří splňují kritéria screeningu a souhlasí s účastí ve studii, bude uvedeno datum.

V den pohovoru jim bude vydán formulář informovaného souhlasu. Jakmile bude podepsán, budou požádáni o vyplnění klinického záznamníku a byly odebrány vzorky séra pro biochemická stanovení včetně stavu vitaminu D.

Jakmile pacienti dokončí počáteční hodnocení, další návštěva bude naplánována o dva týdny později. Pacienti s výsledkem hypovitaminózy D budou náhodně rozděleni do jedné ze dvou skupin: Skupina 1. Suplementace vitaminem D3 a Skupina 2. Dietní doporučení. Dvě skupiny dostaly instrukce, aby dodržovaly dietní doporučení nebo dostávaly suplementaci vitaminem D3 a dokončily lékařská měření. Kromě toho vyšetřovatelé zahrnovali pacienty se SSc s dostatkem vitaminu D a dalšího pacienta se zdravými dárci.

Při druhé návštěvě (o čtyři týdny později) budou zaznamenána klinická data a následující parametry: vápník, fosfor, parathormon podle quimioluniscencie 25-hydroxyvitamin D sérový stav pomocí ELISA, intracelulární cytokin (IL-2, INF-γ, IL- 4 a IL-10) produkce z Th1, Th2 a Treg lymfocytů průtokovou cytometrií.

Skupina 1. Denní orální dávky 5 000 UI vitaminu D3 během 4 týdnů.

Skupina 2. Dietní doporučení dle doporučení pro normální denní příjem vitaminu D v potravě po dobu 4 týdnů.

A navíc výzkumníci zahrnují SSc skupinu s dostatkem vitaminu D a zdravé dárce jako komparátory.

Každá skupina dostane písemné pokyny týkající se užívání drog. Na konci suplementace bude naplánována další návštěva za účelem kontroly souladu s léčbou (budou spočítány zbývající tobolky) a pacienti dokončí druhá klinická hodnocení a stav vápníku, fosforu, parathormonu pomocí quimioluniscencia 25-hydroxyvitamin D v séru pomocí ELISA, intracelulární produkce cytokinů (IL-2, INF-γ, IL-4 a IL-10) z Th1, Th2 a Treg lymfocytů průtokovou cytometrií. Na závěr bude provedena statistická analýza.

Účastníci budou také požádáni, aby vyplnili formulář zaznamenávající příznaky a potenciální nežádoucí příhody.

Separace lymfocytů Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly izolovány centrifugací v hustotním gradientu (Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich) z čerstvě odebrané venózní krve. Intracelulární produkce cytokinů v PBMC (1x106 buněk/zkumavka) byla stimulována při 37ºC po dobu 4h vápenatou solí Ionomicyn od Streptomyces conglobates (1μg/1x106 buněk, Sigma-Aldrich), Brefeldin A (10μg/1x106 buněk) a Cayman Chemical Company. forbol-12-myristát-13-acetát (PMA-25ng/1 x 106 buněk, Sigma-Aldrich).

Buněčný povrch a intracelulární barvení T lymfocytů PBMC byly resuspendovány s (PBS) fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) a obarveny monoklonálními konjugovanými protilátkami buď fluorescein isothiokynátem (FITC), peridinin chlorofylovým proteinovým komplexem (PerCP), fyko-erythrin (PE) nebo allofykocyanin (APC) a směrovány na CD69 (L/78), CD25, CD3, CD4 (BD PharmigenTM a BD Bioscience) po dobu 20 min. Pro intracelulární barvení IL-4 (BD PharmigenTM), IL-2, INF-γ (BD Fast Immune), FoxP3 (Affymetrix) a IL10 (eBioscinence) byly buňky předtím fixovány pomocí fixačního pufru (BioLegend) po dobu 20 minut při pokojové teplotě Poté následoval promývací krok permeabilizačním pufrem (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) podle protokolů výrobce, poté byly barvené buňky inkubovány s monoklonální protilátkou po dobu 20 minut při teplotě místnosti a resuspendovány v PBS pufru. Hodnocení subpopulací Th1, Th2 a Treg průtokovou cytometrií bylo stanoveno jako procenta exprese IL-2+ a INF-γ+ pro Th1 lymfocyty, IL-4+ pro Th2 a CD25+FoxP3+IL-10+ pro Treg v CD3 +CD4+ brána. Data byla získána a analyzována pomocí čtyřparametrového průtokového cytometru FACS Calibur pomocí softwaru ProCellQuest (Beckman Coulter; BD Biosciences) a softwaru Flowing (verze 2.5.1). Cell Imaging Core .