Immunomodulerende effecten van suppletie met 25-OH vitamine D (SCLERODERMA)

Het onderzoek zal worden uitgevoerd met voorafgaande toestemming van de lokale commissie voor onderzoek en ethiek. Patiënten die recht hebben op onze gezondheidszorg en voldoen aan de screeningcriteria, worden opgenomen.

Patiënten met sclerodermie die in onze database zijn opgenomen, zullen via een telefoongesprek worden uitgenodigd om aan het onderzoek deel te nemen. Patiënten die voldoen aan de screeningcriteria en accepteren om deel te nemen aan het onderzoek zullen een datum krijgen.

Op de dag van het interview krijgen ze het toestemmingsformulier. Zodra het is ondertekend, wordt hen gevraagd om de klinische recorder in te vullen en worden er serummonsters verzameld voor biochemische bepalingen, waaronder de vitamine D-status.

Zodra patiënten de eerste evaluaties hebben voltooid, wordt twee weken later een nieuw bezoek gepland. Patiënten met hypovitaminose D-resultaat worden willekeurig toegewezen aan een van twee groepen: Groep 1. Vitamine D3-suppletie en Groep 2. Dieetaanbevelingen. Twee groepen kregen instructies om de voedingsadviezen op te volgen of vitamine D3-suppletie te krijgen en de medische metingen uit te voeren. Bovendien includeerden de onderzoekers SSc-patiënten met vitamine D-toereikendheid en een andere met gezonde donoren.

Bij het tweede bezoek (vier weken later) worden klinische gegevens en de volgende parameters geregistreerd: calcium, fosfor, bijschildklierhormoon door quimioluniscencia 25-hydroxyvitamine D serumstatus door ELISA, intracellulair cytokine (IL-2, INF-γ, IL- 4 en IL-10) productie uit Th1-, Th2- en Treg-lymfocyten door flowcytometrie.

Groep 1. Dagelijkse orale doseringen van 5.000 IE vitamine D3 gedurende 4 weken.

Groep 2. Voedingsaanbevelingen volgens de aanbevelingen voor normale dagelijkse inname van vitamine D via de voeding gedurende 4 weken.

En bovendien nemen de onderzoekers de SSc-groep met vitamine D-toereikendheid en gezonde donoren beide op als vergelijkingspunten.

Elke groep krijgt schriftelijke instructies over het drugsgebruik. Aan het einde van de suppletie zal er nog een bezoek worden gepland om te controleren of de therapietrouw is (resterende capsules worden geteld) en patiënten zullen de tweede klinische evaluaties en calcium, fosfor, parathyroïd hormoon door quimioluniscencia voltooien 25-hydroxyvitamine D serumstatus door ELISA, intracellulair cytokine (IL-2, INF-γ, IL-4 en IL-10) productie uit Th1-, Th2- en Treg-lymfocyten door flowcytometrie. Aan het einde zal de statistische analyse worden uitgevoerd.

Deelnemers wordt ook gevraagd een formulier in te vullen waarin symptomen en mogelijke bijwerkingen worden geregistreerd.

Lymfocytscheiding Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) werden geïsoleerd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie (Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich) uit vers afgenomen veneus bloed. Intracellulaire cytokineproductie in PBMC's (1x106 cellen/buis) werd gestimuleerd bij 37°C gedurende 4 uur met Ionomicyn calciumzout van Streptomyces conglobates (1μg/1x106 cellen, Sigma-Aldrich), Brefeldin A (10μg/1x106 cellen, Cayman chemical company) en forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA-25ng/1 x106 cellen, Sigma-Aldrich).

Celoppervlak en intracellulaire kleuring van T-cellen PBMC's werden opnieuw gesuspendeerd met (PBS) fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) en gekleurd met monoklonale geconjugeerde antilichamen met ofwel fluoresceïne-isothiocynaat (FITC), peridinine-chlorofyl-eiwitcomplex (PerCP), phyco-erythrin (PE) of allophycocyanin (APC) en gericht op CD69 (L/78), CD25, CD3, CD4 (BD PharmigenTM en BD Bioscience) gedurende 20 minuten. Voor intracellulaire kleuring van IL-4 (BD PharmigenTM), IL-2, INF-γ (BD Fast Immune), FoxP3 (Affymetrix) en IL10 (eBioscinence), werden cellen eerder gefixeerd met fixatiebuffer (BioLegend) gedurende 20 min. temperatuur gevolgd door een wasstap met permeabilisatiebuffer (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) volgens de protocollen van de fabrikant, vervolgens werden kleurende cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met monoklonaal antilichaam en opnieuw gesuspendeerd in PBS-buffer. Evaluatie van Th1-, Th2- en Treg-subpopulaties door flowcytometrie werden bepaald als IL-2+- en INF-γ+-percentages voor Th1-lymfocyten, IL-4+ voor Th2 en CD25+FoxP3+IL-10+ voor Treg binnen de CD3 +CD4+ poort. Gegevens werden verkregen en geanalyseerd met behulp van een flowcytometer met vier parameters FACS Calibur met behulp van ProCellQuest-software (Beckman Coulter; BD Biosciences) en Flowing Software (versie 2.5.1) Kern voor celbeeldvorming.