Efeitos imunomoduladores da suplementação com 25-OH vitamina D (SCLERODERMA)

O estudo será realizado com autorização prévia do Comitê de Ética e Pesquisa local. Serão incluídos pacientes com direito a nossos serviços de saúde e que cumpram os critérios de triagem.

Os pacientes com esclerodermia incluídos em nosso banco de dados serão convidados a participar do estudo por meio de ligação telefônica. Os pacientes que cumprirem os critérios de triagem e aceitarem participar do estudo receberão uma data.

No dia da entrevista, eles receberão o formulário de consentimento informado. Uma vez assinado, eles serão solicitados a preencher o registro clínico e amostras de soro serão coletadas para determinações bioquímicas, incluindo o status de vitamina D.

Depois que os pacientes concluírem as avaliações iniciais, outra consulta será agendada duas semanas depois. Os pacientes com resultado de hipovitaminose D serão distribuídos aleatoriamente em um dos dois grupos: Grupo 1. Suplementação de vitamina D3 e Grupo 2. Recomendações dietéticas. Dois grupos receberam instruções para seguir as recomendações dietéticas ou receber suplementação de vitamina D3 e completar as medições médicas. Além disso, os investigadores incluíram pacientes com ES com suficiência de vitamina D e outro com doadores saudáveis.

Na segunda visita (quatro semanas depois), os dados clínicos e os seguintes parâmetros serão registrados: cálcio, fósforo, hormônio da paratireóide por quimioluniscencia 25-hidroxivitamina D estado sérico por ELISA, citocina intracelular (IL-2, INF-γ, IL- 4 e IL-10) a partir de linfócitos Th1, Th2 e Treg por citometria de fluxo.

Grupo 1. Doses orais diárias de 5.000 UI de vitamina D3 durante 4 semanas.

Grupo 2. Recomendações dietéticas de acordo com as recomendações de ingestão diária normal de vitamina D na alimentação durante 4 semanas.

Além disso, os investigadores estão incluindo o grupo ES com suficiência de vitamina D e doadores saudáveis ​​como comparadores.

Cada grupo receberá instruções por escrito sobre o uso de drogas. Ao final das suplementações será agendada outra consulta para verificar a adesão ao tratamento (serão contabilizadas as cápsulas restantes) e os pacientes farão as segundas avaliações clínicas e avaliação de cálcio, fósforo, paratormônio por quimioluniscencia 25-hidroxivitamina D estado sérico por ELISA, intracelular produção de citocinas (IL-2, INF-γ, IL-4 e IL-10) a partir de linfócitos Th1, Th2 e Treg por citometria de fluxo. Ao final será realizada a análise estatística.

Os participantes também serão solicitados a preencher um formulário registrando sintomas e possíveis eventos adversos.

Separação de Linfócitos Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade (Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich) de sangue venoso recém-colhido. A produção intracelular de citocinas em PBMCs (1x106 células/tubo) foi estimulada a 37ºC por 4h com sal de cálcio Ionomicyn de Streptomyces conglobates (1μg/ 1 x106 células, Sigma-Aldrich), Brefeldin A (10μg/ 1 x106 células, Cayman Chemical Company) e forbol-12-miristato-13-acetato (PMA-25ng/1 x106 células, Sigma-Aldrich).

Superfície celular e coloração intracelular de células T PBMCs foram ressuspensos com (PBS) solução salina tamponada com fosfato (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) e corados com anticorpos monoclonais conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), complexo peridinina clorofila proteica (PerCP), ficoeritrina (PE) ou aloficocianina (APC) e direcionado para CD69 (L/78), CD25, CD3, CD4 (BD PharmigenTM e BD Bioscience) por 20 min. Para coloração intracelular de IL-4 (BD PharmigenTM), IL-2, INF-γ (BD Fast Immune), FoxP3 (Affymetrix) e IL10 (eBioscinence), as células foram previamente fixadas usando tampão de fixação (BioLegend) por 20 min em ambiente temperatura seguida por uma etapa de lavagem com tampão de permeabilização (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) de acordo com os protocolos do fabricante, então as células de coloração foram incubadas com anticorpo monoclonal por 20 min em temperatura ambiente e ressuspensas em tampão PBS. A avaliação das subpopulações Th1, Th2 e Treg por citometria de fluxo foi determinada como expressão percentual de IL-2+ e INF-γ+ para linfócitos Th1, IL-4+ para Th2 e CD25+FoxP3+IL-10+ para Treg dentro do CD3 porta +CD4+. Os dados foram adquiridos e analisados ​​usando um citômetro de fluxo de quatro parâmetros FACS Calibur usando o software ProCellQuest (Beckman Coulter; BD Biosciences) e Flowing Software (Versão 2.5.1) Núcleo de imagem celular.