Effets immunomodulateurs de la supplémentation en vitamine D 25-OH (SCLERODERMA)

L'étude sera réalisée avec l'autorisation préalable du Comité local de recherche et d'éthique. Les patients ayant droit à nos services de santé et répondant aux critères de sélection seront inclus.

Les patients atteints de sclérodermie inclus dans notre base de données seront invités à participer à l'étude par un appel téléphonique. Les patients répondant aux critères de sélection et acceptant de participer à l'étude se verront attribuer une date.

Le jour de l'entretien, le formulaire de consentement éclairé leur sera remis. Une fois qu'il a été signé, il leur sera demandé de remplir le registre clinique et des échantillons de sérum ont été prélevés pour des déterminations biochimiques, y compris le statut en vitamine D.

Une fois que les patients ont terminé les évaluations initiales, une autre visite sera prévue deux semaines plus tard. Les patients présentant un résultat d'hypovitaminose D seront répartis au hasard dans l'un des deux groupes : Groupe 1. Supplémentation en vitamine D3 et Groupe 2. Recommandations diététiques. Deux groupes ont reçu des instructions pour suivre les recommandations diététiques ou pour recevoir une supplémentation en vitamine D3 et compléter les mesures médicales. De plus, les enquêteurs ont inclus des patients SSc avec une suffisance en vitamine D et un autre avec des donneurs sains.

Lors de la deuxième visite (quatre semaines plus tard), les données cliniques et les paramètres suivants seront enregistrés : calcium, phosphore, hormone parathyroïdienne par quimioluniscencia 25-hydroxyvitamine D statut sérique par ELISA, cytokine intracellulaire (IL-2, INF-γ, IL- 4 et IL-10) production à partir de lymphocytes Th1, Th2 et Treg par cytométrie en flux.

Groupe 1. Doses orales quotidiennes de 5 000 UI de vitamine D3 pendant 4 semaines.

Groupe 2. Recommandations diététiques selon les recommandations pour l'apport quotidien normal de vitamine D dans les aliments pendant 4 semaines.

De plus, les enquêteurs incluent le groupe SSc avec une suffisance en vitamine D et des donneurs sains à la fois comme comparateurs.

Chaque groupe recevra des instructions écrites concernant l'utilisation des médicaments. À la fin des supplémentations, une autre visite sera programmée pour vérifier l'observance du traitement (les capsules restantes seront comptées) et les patients compléteront les deuxièmes évaluations cliniques et le calcium, le phosphore, l'hormone parathyroïdienne par quimioluniscencia 25-hydroxyvitamine D statut sérique par ELISA, intracellulaire production de cytokines (IL-2, INF-γ, IL-4 et IL-10) à partir de lymphocytes Th1, Th2 et Treg par cytométrie en flux. À la fin, l'analyse statistique sera effectuée.

Les participants seront également invités à remplir un formulaire enregistrant les symptômes et les événements indésirables potentiels.

Séparation des lymphocytes Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été isolées par centrifugation en gradient de densité (Ficoll-Hypaque ; Sigma-Aldrich) à partir de sang veineux fraîchement prélevé. La production intracellulaire de cytokines dans les PBMC (1x106 cellules/tube) a été stimulée à 37°C pendant 4h avec du sel de calcium Ionomicyn de Streptomyces conglobates (1μg/ 1 x106 cellules, Sigma-Aldrich), Brefeldin A (10μg/ 1 x106 cellules, Cayman chemical company) et phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA-25ng/1 x 106 cellules, Sigma-Aldrich).

Surface cellulaire et coloration intracellulaire des lymphocytes T Les PBMC ont été remis en suspension avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) et colorées avec des anticorps monoclonaux conjugués avec soit de l'isothiocynate de fluorescéine (FITC), soit du complexe protéique péridinine chlorophylle (PerCP), phyco-érythrine (PE) ou allophycocyanine (APC) et dirigé vers CD69 (L/78), CD25, CD3, CD4 (BD PharmigenTM et BD Bioscience) pendant 20 min. Pour la coloration intracellulaire d'IL-4 (BD PharmigenTM), IL-2, INF-γ (BD Fast Immune), FoxP3 (Affymetrix) et IL10 (eBioscinence), les cellules étaient préalablement fixées à l'aide d'un tampon de fixation (BioLegend) pendant 20 min à la pièce température suivi d'une étape de lavage avec un tampon de perméabilisation (Perm/Wash Buffer BD Pharmigen TM) selon les protocoles du fabricant, puis les cellules colorées ont été incubées avec l'anticorps monoclonal pendant 20 min à température ambiante et remises en suspension dans du tampon PBS. L'évaluation des sous-populations Th1, Th2 et Treg par cytométrie en flux a été déterminée par les pourcentages d'expression d'IL-2+ et d'INF-γ+ pour les lymphocytes Th1, d'IL-4+ pour Th2 et de CD25+FoxP3+IL-10+ pour Treg dans le CD3 Porte +CD4+. Les données ont été acquises et analysées à l'aide d'un cytomètre en flux à quatre paramètres FACS Calibur à l'aide du logiciel ProCellQuest (Beckman Coulter; BD Biosciences) et du logiciel Flowing (version 2.5.1) Noyau d'imagerie cellulaire.