Ozanimodin vaikutukset immuunivälitteisiin neurodegeneraation mekanismeihin multippeliskleroosissa - prekliininen tutkimus

Multippeliskleroosi (MS) on monitekijäinen ja monimutkainen sairaus, jossa on useita sekalaisia ​​patofysiologisia mekanismeja, jotka ovat vastuussa tulehduksellisista ja hermostoa rappeutuvista vaurioista. Tulehdusreitteihin kohdistetut hoidot ovat tuoneet merkittävää edistystä uusiutuvan remittoivan MS-taudin hoidossa. Valitettavasti näiden hoitojen vaikutus hermoston rappeutumiseen on rajallinen. Ongelman monimutkaisuuden ratkaisemiseksi yhdistelmähoito voi olla tarpeen. Turvallisuus-, siedettävyys- ja kustannusongelmat ovat kuitenkin toistaiseksi rajoittaneet tätä vaihtoehtoa. Yksittäiset hoidot, jotka kohdistuvat samanaikaisesti tulehdukseen ja hermoston rappeutumiseen, ovat houkutteleva vaihtoehto. Niiden vaikutusten kattava ymmärtäminen on kuitenkin välttämätöntä niiden vaikutuksen maksimoimiseksi.

Otsanimodi on molekyyli, joka kohdistuu samanaikaisesti tulehdukseen ja hermoston rappeutumiseen. Sen vaikutus jälkimmäiseen on vähemmän ymmärretty. Lääke tuottaa vaikutuksensa vaikuttamalla kahteen (S1P1 ja S1P5) viidestä sfingosiini-1-fosfaatti G-proteiiniin kytketystä reseptorin alatyypistä. Vaikka lääkkeen molekyylikohteet on tarkasti määritelty, paljon on vielä opittavaa monista biologisista vaikutuksista, jotka voivat seurata reseptorien modulaatiota.

Yhteistyötä ja integroitua lähestymistapaa ehdotetaan syventämään ymmärrystämme otsanimodin vaikutuksista MS-taudin monimutkaiseen patofysiologiaan.

Tutkimus keskittyy MS-biologian kannalta oleellisiin näkökohtiin. Erityisesti tutkitaan, kuinka otsanimodi voi verrata neurodegeneratiivisia mekanismeja, jotka laukaisevat adaptiivisen immuunivasteen molemmat haarat (T- ja B-solut) ja niiden suboptimaalinen säätely MS:ssä. Kaiken kaikkiaan hankkeen tavoitteena on tutkia:

AIM1: otsanimodin kyky moduloida aktiivisista MS-potilaista peräisin olevien T-solujen synaptotoksista vaikutusta MS-kimeerisessä ex vivo -mallissa ja tunnistaa mahdolliset välittäjät (IRCCS Neuromed-Pozzilli, yhteistyössä Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. järjestelmälääketiede, Rooman Tor Vergata -yliopisto). Tulehduksellinen synaptopatia, nimittäin synapsin menetys ja synaptinen toimintahäiriö, on nousemassa MS-taudin ja sen hiirimallin kokeellisen autoimmuunisen enkefalomyeliitin (EAE) harmaan aineen patologian tärkeäksi tunnusmerkiksi. Viime vuosina on saatu näyttöä MS-potilaista tai EAE-hiiristä peräisin olevien T-solujen suorasta roolista glutamaattivälitteisen eksitotoksisuuden indusoinnissa, joka on merkittävä synaptopatian muoto, joka on havaittu MS/EAE-aivoissa. Erityisesti useat todisteet osoittavat, että glutamaatti-eksitotoksisuuden rajoittaminen on houkutteleva terapeuttinen strategia MS-taudin hoidossa.

Äskettäin tutkittiin otsanimodin moduloivia vaikutuksia tulehdukselliseen glutamaattivälitteiseen eksitotoksisuuteen ja sfingosiinireseptorin alatyyppien (S1P1 ja S1P5) erilaista osallistumista arvioitiin EAE-mallissa. Kaksi päätulosta ilmeni: ensinnäkin S1P1/S1P5-modulaattori otsanimodilla on keskushermostoa suojaavia vaikutuksia, jotka todennäköisesti välittyvät mikrogliasoluihin ja tunkeutuviin lymfosyytteihin kohdistuvan vaikutuksen kautta, mikä johtaa tulehduksellisen synaptopatian tärkeimpien toimijoiden, proinflammatoristen sytokiinien vähenemiseen. Toiseksi, selektiivisen S1P1-modulaattorin keskitetty annostelu osoitti hermostoa suojaavia vaikutuksia sekä EAE:n kliinisen pistemäärän että tulehduksellisen synaptopatian suhteen, mikä viittaa tämän reseptorin alatyypin ensisijaiseen osallisuuteen otsanimodin aiheuttamassa hermosuojassa myös MS:ssä.

Tässä projektissa käytetään Tor Vergatan yliopiston laboratoriossa äskettäin kehitettyä MS-kimeeristä ex-vivo -mallia. T-solut, jotka eristettiin aktiivisista uusiutuvista remittoivista MS-potilaista, mutta eivät ei-aktiivisista (naMS) ja terveistä koehenkilöistä (HS), indusoivat spontaanien glutamatergisten virtojen lisääntymistä, joka muistuttaa EAE T-solujen aiheuttamia muutoksia.

Tässä projektin erityistavoitteessa arvioidaan seuraavaa näkökohtaa: i) tutkia, pystyykö otsanimod moduloimaan aktiivisista MS-potilaista peräisin olevan T dellin synaptotoksista vaikutusta MS-kimeerisessä ex vivo -mallissa ja ii) tunnistamaan sfingosiinireseptorin alatyypit ja iii) mahdollisesti mukana olevat liukoiset molekyylit.

Osanimodin roolin MS-aivoissa kiertävien synaptotoksisten T-solujen aiheuttamien eksitotoksisten vaurioiden vaimentamisessa odotetaan paljastuvan riippumatta T-solukaupan estämisestä.

AIM2: otsanimodin kyky vähentää sytokiinivälitteistä BBB:n hajoamista ja tässä tutkittujen immuunisolujen migraatiota BBB:n ex vivo -mallien kautta (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). B- ja T-lymfosyytit sekä NK-solut osallistuvat MS-patogeneesiin (Lassmann, 2019). Ne käyttävät S1P1- ja S1P5-reseptoreita eri tavoin säätelemään liikennettä sekundaaristen imukudosten läpi ja pääsemään keskushermostoon BBB:n kautta (Sallusto et al., 2012). Nämä reseptorit puolestaan ​​ovat tärkeitä BBB:n eheyden ylläpitämisessä ja toiminnan palauttamisessa (Chun 2021).

S1P1- ja S1P5-reseptorien modulaattoreita käytetään laajalti MS-taudin hoidossa, mutta niiden vaikutustapa tunnetaan vain osittain johtuen immuunisolujen membraanipinnoilla sekä immuunisolujen endoteelisoluissa ja podosyyteissä olevien yhdistettyjen vuorovaikutusten monimutkaisista myötävirtavaikutuksista. BBB. Näitä moduloivia ominaisuuksia on tutkittu pääasiassa fingolimodille, tämän luokan ensimmäiselle MS-taudissa käytetylle lääkkeelle, kun taas otsanimodin vaikutusmekanismit vaativat perusteellisia tutkimuksia. Tällä lääkkeellä on todellakin erilainen kemiallinen rakenne kuin fingolimodilla, sitoutuminen rajoittuu S1P1- ja S1P5-reseptoreihin verrattuna fingolimodin S1P1-, S1P3-, S1P4- ja S1P5-reseptoreihin, erilainen farmakokinetiikka ja lyhyempi eliminaation puoliintumisaika (Chun et al., 2021). ).

Tämän erityisen tavoitteen tarkoituksena on arvioida transwell-pohjaisten järjestelmien ja organoidien kautta hyödynnetyn ihmisen BBB:n ex vivo -malleissa otsanimodin vaikutuksia: i) BBB:n eheyden ylläpitämiseen sytokiinivälitteisen esteen hajoamisen yhteydessä; ii) heikentää T-solujen ja NK-solujen migraatiota BBB:n läpi.

MS-potilaiden perifeerisen veren mononukleaarisolujen (PBMC:iden) ex vivo -altistuksen otsanimodille odotetaan vähentävän tulehdusta edistävien sytokiinien välittämää BBB-vauriota sekä vähentävän näiden immuunisolujen kykyä BBB:n yli. NMOSD-potilaiden PBMC:itä käytetään myös tulehduskontrollina, koska näissä sairauksissa Th17-soluilla on tärkeä patogeneettinen rooli yhdessä BBB:hen kohdistuvien AQP-4-vasta-aineiden kanssa.

AIM3: otsanimodin kyky vaikuttaa Epstein-Barr-viruksella (EBV) infektoituneiden B-solujen migraatioominaisuuksiin MS:ssä (Sant'Andrean sairaala).

Yleisessä populaatiossa B-lymfosyyttien muistin alajoukko, jonka osoitettiin vähentyneen S1P-reseptorimodulaattoreilla hoidon aikana, on se, joka sisältää selektiivisesti EBV:tä piilevänä infektoivana aineena. Useat EBV-genotyyppejä koskevat tutkimukset osoittivat spesifisten Epstein-Barrin ydinantigeeni 2:n (EBNA2) geenivarianttien yhteyden MS-tautiin. EBNA2 toimii transaktivaattorina sekä viruksen että solun geenipromoottoreissa/tehostajissa pakollisen vuorovaikutuksen kautta isäntäsolun transkriptiotekijöiden kanssa. Kun otetaan huomioon monimutkainen vuorovaikutus EBNA2:n ja solukomponenttien välillä, on todennäköistä, että EBNA2-variantit voivat vaikuttaa varhaisen infektion prosesseihin ja osallistua MS-taudin viruksen ja isännän epäsääntelyyn. Myös MS-tautiin liittyvät EBNA2-variantit näyttävät häiritsevän B-solujen migraatiota ja kypsymistä itukeskuksissa. Vaikka EBV-infektion esiintyminen MS-aivoissa on kiistanalaista, jotkin havainnot tukevat näyttöä intratekaalisesta reaktivaatiosta ja virusperäisestä immunopatogeenisesta vasteesta MS:ssä. Tämän erityistavoitteen hypoteesi on, että otsanimodilla voi olla immunomodulatorisia vaikutuksia B-soluihin ja EBV-infektoituneisiin soluihin MS-kontekstissa. Kuten jo mainittiin, otsanimodi on voimakas S1P1R-modulaattori, joka estää lymfosyyttien poistumista imukudoksesta. B-soluja ja lymfoblastoidisolulinjoja [spontaanisti ulos kasvavia (spLCL:t) tai in vitro -infektioita EBV-laboratoriokannalla B95.8 (95,8LCL)] käytetään tutkimaan, kuinka EBV-infektio vaikuttaa migraatiokykyyn ja kuinka otsanimodi vaikuttaa tähän kapasiteettiin.

Erityisesti tutkitaan seuraavaa näkökohtaa: i) B-solujen, spLCL:iden ja B95.8LCL:ien migraatio-ominaisuudet MS-potilailta ja iän ja sukupuolen mukaan vastaavilta terveiltä luovuttajilta (HD); ii) jos otsanimodi pystyy moduloimaan edellä mainittujen solujen migraatio-ominaisuuksia potilaista ja HD:stä.

Tämä tutkimus parantaa merkittävästi tietoa otsanimodin vaikutuksesta B-soluihin ja EBV-tartunnan saaneiden B-solujen kulkeutumiseen imusolmukkeiden läpi ja jopa aivoissa.

AIM4: otsanimodin kyky moduloida säätelevien T-solujen (Treg) määrää ja/tai toimintaa. Se on lymfosyyttipopulaatio, jolla on keskeinen rooli autoimmuunivasteiden säätelyssä (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Napoli, Italia, joka vastaanottaa verinäytteitä Neuromedin sairaalasta ja Sant'Andrean sairaalasta; ei rekrytointiyksikköä). Solunsisäiset aineenvaihduntareitit pystyvät kontrolloimaan eri immuunisolujen alaryhmien induktiota ja toimintaa, todellakin glykolyysi on välttämätön ihmisen iTreg-solujen tuottamiseksi Tconv-soluista. Lisäksi glykolyyttinen vika Tconv-solujen aktivoinnin aikana MS- ja T1D-potilailla liittyi iTreg-solujen vähentyneeseen induktioon ja suppressiiviseen toimintaan näillä potilailla, mikä viittaa iTreg-solujen puutteelliseen toimintaan autoimmuniteetin aikana. Otsanimodin vaikutusta T-lymfosyyttien ja iTreg-solujen metaboliseen profiiliin tutkitaan. Erityisesti tällä erityisellä tavoitteella arvioidaan i) otsanimodin kykyä vaikuttaa T-solujen ja iTreg-solujen toimintaan/aktiivisuuteen (aktivaatio, proliferaatio, suppressio, Foxp3-induktio) ja ii) kiertävien T-solupopulaatioiden metabolinen voimavara (ts. glykolyysin ja oksidatiivisen fosforylaation mittaus), jotka on puhdistettu terveistä koehenkilöistä ja MS-potilaista.

Otsanimodin odotetaan pystyvän kontrolloimaan Tconv- ja iTreg-solujen immunometaboliaa RRMS-potilailla. Tavoitteena on myös arvioida, pystyykö otsanimod muuttamaan iTreg-solujen induktiota terveillä kontrolleilla ja RRMS-potilailla.