Wpływ ozanimodu na immunologiczne mechanizmy neurodegeneracji w stwardnieniu rozsianym - badanie przedkliniczne

Stwardnienie rozsiane (SM) jest wieloczynnikową i złożoną chorobą o kilku splątanych mechanizmach patofizjologicznych, odpowiedzialnych za uszkodzenia zapalne i neurodegeneracyjne. Terapie ukierunkowane na szlaki zapalne przyniosły znaczny postęp w leczeniu rzutowo-remisyjnej postaci SM. Niestety, wpływ tych terapii na neurodegenerację jest ograniczony. Aby poradzić sobie ze złożonością problemu, konieczne mogą być terapie skojarzone. Jednak kwestie bezpieczeństwa, tolerancji i kosztów dotychczas ograniczały tę opcję. Atrakcyjną alternatywą są pojedyncze terapie, które są jednocześnie ukierunkowane na zapalenie i neurodegenerację. Jednak pełne zrozumienie ich skutków jest niezbędne, aby zmaksymalizować ich wpływ.

Ozanimod to cząsteczka, która działa jednocześnie na zapalenie i neurodegenerację. Jego wpływ na te ostatnie jest mniej zrozumiały. Lek wywołuje swoje efekty, działając na dwa (S1P1 i S1P5) z pięciu podtypów receptorów sprzężonych z białkiem G sfingozyno-1-fosforanu. Chociaż cele molekularne leku są dokładnie określone, wiele pozostaje do odkrycia na temat wielu efektów biologicznych, które mogą wynikać z modulacji receptorów.

Proponuje się wspólne i zintegrowane podejście, aby pogłębić nasze zrozumienie wpływu ozanimodu na złożoną patofizjologię SM.

Badania skupią się na kluczowych aspektach biologii stwardnienia rozsianego. W szczególności zostanie zbadane, w jaki sposób ozanimod może kontrastować z mechanizmami neurodegeneracyjnymi wyzwalanymi przez oba ramiona nabytej odpowiedzi immunologicznej (komórki T i B) oraz przez ich suboptymalną regulację w SM. Ogólnie rzecz biorąc, projekt ma na celu zbadanie:

AIM1: zdolność ozanimodu do modulowania synaptotoksycznego działania komórek T pochodzących od pacjentów z aktywnym SM w chimerycznym modelu ex vivo MS i do identyfikacji możliwych mediatorów (IRCCS Neuromed-Pozzilli, we współpracy z Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Medycyny Systemowej, Uniwersytet Tor Vergata w Rzymie). Zapalna synaptopatia, a mianowicie utrata synaps i dysfunkcja synaptyczna, wyłania się jako ważna cecha charakterystyczna patologii istoty szarej w SM i jego mysim modelu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). W ostatnich latach dostarczono dowodów na bezpośrednią rolę limfocytów T, pochodzących od pacjentów z SM lub myszy EAE, w indukowaniu ekscytotoksyczności za pośrednictwem glutaminianu, dominującej formy synaptopatii wykrytej w mózgu MS/EAE. Warto zauważyć, że kilka linii dowodów wskazuje, że ograniczenie ekscytotoksyczności glutaminianu jest atrakcyjną strategią terapeutyczną w leczeniu SM.

Niedawno zbadano modulujące działanie ozanimodu na zapalną ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu i oceniono różne zaangażowanie podtypów receptorów sfingozyny (S1P1 i S1P5) w modelu EAE. Uzyskano dwa główne wyniki: po pierwsze, modulator S1P1/S1P5, ozanimod, wywiera ośrodkowe działanie neuroprotekcyjne, prawdopodobnie za pośrednictwem działania na komórki mikrogleju i naciekające limfocyty, co skutkuje zmniejszonym uwalnianiem cytokin prozapalnych, głównych graczy w synaptopatii zapalnej. Po drugie, centralne dostarczanie selektywnego modulatora S1P1 wykazało działanie neuroprotekcyjne, zarówno pod względem oceny klinicznej EAE, jak i synaptopatii zapalnej, co sugeruje pierwotne zaangażowanie tego podtypu receptora w indukowaną ozanimodem neuroprotekcję również w SM.

W niniejszym projekcie wykorzystany zostanie chimeryczny model MS ex-vivo, opracowany niedawno w laboratorium Uniwersytetu Tor Vergata. Limfocyty T izolowane od pacjentów z aktywnym rzutowo-remisyjnym stwardnieniem rozsianym, ale nie od nieaktywnych (naMS) i zdrowych osobników (HS), indukowały wzrost spontanicznych prądów glutaminergicznych, przypominając zmiany indukowane przez limfocyty T EAE.

W ramach tego konkretnego celu projektu ocenie poddane zostaną następujące aspekty: i) zbadanie, czy ozanimod jest w stanie modulować działanie synaptotoksyczne T. dell pochodzące od pacjentów z aktywnym SM w chimerycznym modelu ex vivo ze stwardnieniem rozsianym oraz ii) zidentyfikowanie podtypy receptora sfingozyny oraz iii) potencjalnie zaangażowane cząsteczki rozpuszczalne.

Oczekuje się, że ujawniona zostanie rola ozanimodu w tłumieniu ekscytotoksycznego uszkodzenia powodowanego przez synaptotoksyczne limfocyty T krążące w mózgu SM, niezależnie od zapobiegania przemieszczaniu się limfocytów T.

AIM2: zdolność ozanimodu do zmniejszania rozpadu BBB za pośrednictwem cytokin i migracji badanych tutaj komórek odpornościowych za pomocą modeli ex vivo BBB (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). Limfocyty B i T oraz komórki NK biorą udział w patogenezie SM (Lassmann, 2019). W różny sposób wykorzystują receptory S1P1 i S1P5 do regulowania ruchu przez wtórne tkanki limfatyczne i do wchodzenia do OUN przez BBB (Sallusto i in., 2012). Z kolei te receptory są ważne w utrzymaniu integralności i przywracaniu funkcji BBB (Chun 2021).

Modulatory receptorów S1P1 i S1P5 są szeroko stosowane w leczeniu stwardnienia rozsianego, ale ich sposób działania jest tylko częściowo poznany ze względu na złożone skutki połączonych interakcji między receptorami zlokalizowanymi na powierzchni błony komórkowej komórek odpornościowych oraz na komórkach śródbłonka i podocytach BBB. Te właściwości modulujące badano głównie dla fingolimodu, pierwszego leku tej klasy stosowanego w SM, podczas gdy mechanizmy działania ozanimodu wymagają dogłębnych badań. Rzeczywiście, ten lek ma inną strukturę chemiczną niż fingolimod, wiązanie ograniczone do receptorów S1P1 i S1P5 w porównaniu z S1P1, S1P3, S1P4 i S1P5 fingolimodu, inną farmakokinetykę i krótszy okres półtrwania w fazie eliminacji (Chun i in., 2021 ).

Celem tego konkretnego celu jest ocena, w modelach ex vivo ludzkiego BBB, wykorzystywanych przez systemy i organoidy oparte na transwell, wpływu ozanimodu na: i) utrzymanie integralności BBB w kontekście rozpadu bariery za pośrednictwem cytokin; ii) upośledzenie migracji komórek T i komórek NK przez BBB.

Oczekuje się, że ekspozycja ex vivo jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) pacjentów ze stwardnieniem rozsianym na ozanimod zmniejszy uszkodzenie BBB, w którym pośredniczą cytokiny prozapalne, a także złagodzi zdolność tych komórek odpornościowych przez BBB. PBMC pacjentów z NMOSD będą również wykorzystywane jako kontrole stanu zapalnego, ponieważ w tych zaburzeniach komórki Th17 odgrywają główną rolę patogenetyczną wraz z skierowanymi na BBB przeciwciałami AQP-4.

AIM3: zdolność ozanimodu do wpływania na właściwości migracyjne komórek B zakażonych wirusem Epsteina-Barra (EBV) w SM (szpital Sant'Andrea).

W populacji ogólnej podzbiór limfocytów B pamięci, który okazał się zmniejszony podczas terapii modulatorami receptorów S1P, jest tym, który selektywnie przenosi EBV jako utajony czynnik zakażający. Kilka badań nad genotypami EBV wykazało związek specyficznych wariantów genu antygenu jądrowego 2 Epsteina-Barra (EBNA2) ze stwardnieniem rozsianym. EBNA2 działa jako transaktywator zarówno promotorów/wzmacniaczy genów wirusowych, jak i komórkowych poprzez obowiązkowe interakcje z czynnikami transkrypcyjnymi komórki gospodarza. Biorąc pod uwagę złożoną interakcję między EBNA2 a komponentami komórkowymi, prawdopodobne jest, że warianty EBNA2 mogą wpływać na procesy wczesnej infekcji i uczestniczyć w rozregulowanych interakcjach wirus-gospodarz w SM. Również warianty EBNA2 związane z SM wydają się zakłócać migrację i dojrzewanie komórek B w ośrodkach rozmnażania. Pomimo, że obecność infekcji EBV w mózgu SM jest kontrowersyjna, niektóre obserwacje potwierdzają dowody na reaktywację wewnątrzkanałową i odpowiedź immunopatogenną wywołaną przez wirusy w SM. Hipotezą tego konkretnego celu jest to, że ozanimod może mieć działanie immunomodulujące na limfocyty B i komórki zakażone EBV w kontekście stwardnienia rozsianego. Jak już wspomniano, ozanimod jest silnym modulatorem S1P1R, który hamuje wychodzenie limfocytów z tkanek limfatycznych. Komórki B i linie komórek limfoblastoidalnych [spontanicznie wyrastające (spLCL) lub zakażone in vitro szczepem laboratoryjnym EBV B95.8 (95,8LCL)] zostaną wykorzystane do zbadania, w jaki sposób zakażenie EBV wpływa na zdolność migracji i jak na tę zdolność wpływa ozanimod.

W szczególności zbadane zostaną następujące aspekty: i) właściwości migracyjne komórek B, spLCL i B95.8LCL od pacjentów z SM oraz zdrowych dawców dobranych pod względem wieku i płci (HD); ii) czy ozanimod jest w stanie modulować właściwości migracji powyższych komórek od pacjentów i HD.

Badania te znacznie poszerzą wiedzę na temat wpływu ozanimodu na komórki B i migrację komórek B zakażonych EBV przez narządy limfatyczne, a nawet w mózgu.

AIM4: zdolność ozanimodu do modulowania liczby i/lub funkcji regulatorowych limfocytów T (Treg), populacji limfocytów odgrywających kluczową rolę w kontroli odpowiedzi autoimmunologicznych (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli „Federico II”, Neapol, Włochy, otrzymujące próbki krwi ze szpitali Neuromed i Sant'Andrea; jednostka nie rekrutująca). Wewnątrzkomórkowe szlaki metaboliczne są w stanie kontrolować indukcję i funkcję różnych podzbiorów komórek odpornościowych, w rzeczywistości glikoliza jest niezbędna do wytwarzania ludzkich komórek iTreg z komórek Tconv. Ponadto defekt glikolityczny podczas aktywacji komórek Tconv u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i T1D był związany ze zmniejszoną indukcją i funkcją supresyjną komórek iTreg u tych pacjentów, co sugeruje wadliwą funkcję komórek iTreg podczas autoimmunizacji. Zbadany zostanie wpływ ozanimodu na komórkowy profil metaboliczny limfocytów T oraz komórek iTreg. W szczególności ten konkretny cel oceni i) zdolność ozanimodu do wpływania na funkcję/aktywność komórek T i komórek iTreg (aktywacja, proliferacja, supresja, indukcja Foxp3) oraz ii) atut metaboliczny populacji krążących komórek T (tj. pomiar glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej) oczyszczone od zdrowych osobników i pacjentów z SM.

Oczekuje się, że ozanimod będzie w stanie kontrolować immunometabolizm komórek Tconv i iTreg u pacjentów z RRMS. W tym celu zostanie również oceniona, czy ozanimod jest w stanie modyfikować indukcję komórek iTreg u zdrowych osób z grupy kontrolnej i pacjentów z RRMS.