Effecten van Ozanimod op immuungemedieerde mechanismen van neurodegeneratie bij multiple sclerose - een preklinisch onderzoek

Multiple sclerose (MS) is een multifactoriële en complexe ziekte met verschillende verwarde pathofysiologische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor inflammatoire en neurodegeneratieve schade. Therapieën gericht op ontstekingsroutes hebben aanzienlijke vooruitgang gebracht in de behandeling van relapsing-remitting MS. Helaas is de impact van deze behandelingen op neurodegeneratie beperkt. Om de complexiteit van het probleem aan te pakken, kunnen combinatietherapieën nodig zijn. Veiligheid, verdraagbaarheid en kosten hebben deze optie echter tot nu toe beperkt. Afzonderlijke therapieën die tegelijkertijd gericht zijn op ontsteking en neurodegeneratie zijn een aantrekkelijk alternatief. Een alomvattend begrip van hun effecten is echter essentieel om hun impact te maximaliseren.

Ozanimod is een molecuul dat tegelijkertijd ontsteking en neurodegeneratie aanpakt. De impact op de laatste is minder goed begrepen. Het medicijn produceert zijn effecten door in te werken op twee (S1P1 en S1P5) van de vijf sfingosine-1-fosfaat G-eiwit-gekoppelde receptorsubtypen. Hoewel de moleculaire doelen van het medicijn precies zijn gedefinieerd, valt er nog veel te leren over de vele biologische effecten die kunnen volgen op de modulatie van receptoren.

Een collaboratieve en geïntegreerde benadering wordt voorgesteld om ons begrip van de effecten van ozanimod op de complexe pathofysiologie van MS te verdiepen.

Het onderzoek zal zich richten op cruciale aspecten voor de MS-biologie. Specifiek zal worden onderzocht hoe ozanimod neurodegeneratieve mechanismen kan contrasteren die worden getriggerd door beide armen van de adaptieve immuunrespons (T- en B-cellen) en door hun suboptimale regulatie bij MS. In het algemeen is het project gericht op het onderzoeken van:

AIM1: het vermogen van ozanimod om het synaptotoxische effect van T-cellen afkomstig van actieve MS-patiënten te moduleren in een MS-chimeer ex-vivo-model en om mogelijke mediatoren te identificeren (IRCCS Neuromed-Pozzilli, in samenwerking met Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Systeemgeneeskunde, Tor Vergata Universiteit van Rome). Inflammatoire synaptopathie, namelijk synapsverlies en synaptische disfunctie, komt naar voren als een belangrijk kenmerk van grijze stofpathologie bij MS en zijn muismodel experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE). In de afgelopen jaren is er bewijs geleverd voor een directe rol van T-cellen, afgeleid van MS-patiënten of EAE-muizen, bij het induceren van door glutamaat gemedieerde excitotoxiciteit, een prominente vorm van synaptopathie die wordt gedetecteerd in de MS/EAE-hersenen. Met name wijzen verschillende bewijslijnen erop dat het beperken van glutamaat-excitotoxiciteit een aantrekkelijke therapeutische strategie is om MS te behandelen.

Onlangs werden de modulerende effecten van ozanimod op inflammatoire glutamaatgemedieerde excitotoxiciteit onderzocht en werd de verschillende betrokkenheid van sfingosinereceptorsubtypen (S1P1 en S1P5) geëvalueerd in het EAE-model. Er kwamen twee belangrijke resultaten naar voren: ten eerste heeft de S1P1/S1P5-modulator ozanimod centrale neuroprotectieve effecten die waarschijnlijk worden gemedieerd door een werking op microgliacellen en infiltrerende lymfocyten, wat resulteert in een verminderde afgifte van pro-inflammatoire cytokines, de belangrijkste spelers van inflammatoire synaptopathie. Ten tweede vertoonde de centrale afgifte van een selectieve S1P1-modulator neuroprotectieve effecten, zowel in termen van EAE-klinische score als inflammatoire synaptopathie, wat suggereert dat dit receptorsubtype primair betrokken is bij door ozanimod geïnduceerde neuroprotectie, ook bij MS.

In het huidige project zal het chimere ex-vivo-model van MS, dat onlangs is ontwikkeld in het laboratorium van Tor Vergata University, worden gebruikt. T-cellen geïsoleerd van actieve relapsing remitting MS-patiënten maar niet van niet-actieve (naMS) en gezonde proefpersonen (HS), veroorzaakten een toename van de spontane glutamaterge stromen, die doen denken aan de veranderingen veroorzaakt door EAE T-cellen.

In dit specifieke doel van het project zullen de volgende aspecten worden beoordeeld: i) onderzoeken of ozanimod in staat is om het synaptotoxische effect van T dell afkomstig van actieve MS-patiënten in het MS-chimere ex-vivo model te moduleren en ii) identificeren sfingosinereceptorsubtypen en iii) oplosbare moleculen die mogelijk betrokken zijn.

Een rol voor ozanimod bij het dempen van excitotoxische schade veroorzaakt door synaptotoxische T-cellen die circuleren in de MS-hersenen, onafhankelijk van een preventie van T-celhandel, zal naar verwachting worden onthuld.

AIM2: het vermogen van ozanimod om de cytokine-gemedieerde afbraak van de BBB en de migratie van de hier bestudeerde immuuncellen te verminderen door middel van ex vivo modellen van BBB (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). B- en T-lymfocyten en NK-cellen zijn betrokken bij de pathogenese van MS (Lassmann, 2019). Ze gebruiken differentieel S1P1- en S1P5-receptoren om hun verkeer door secundaire lymfoïde weefsels te reguleren en om het CZS binnen te gaan via de BBB (Sallusto et al., 2012). Deze receptoren zijn op hun beurt belangrijk voor het behoud van de integriteit en het herstel van de functie van de BBB (Chun 2021).

Modulatoren van S1P1- en S1P5-receptoren worden veel gebruikt om MS te behandelen, maar hun werkingsmechanisme is slechts gedeeltelijk bekend vanwege de complexe stroomafwaartse effecten van de gecombineerde interacties tussen receptoren gelokaliseerd op de membraanoppervlakken van immuuncellen en op de endotheelcellen en podocyten van de BBB. Deze modulerende kenmerken zijn voornamelijk bestudeerd voor fingolimod, het eerste medicijn van deze klasse dat wordt gebruikt bij MS, terwijl de werkingsmechanismen van ozanimod grondig moeten worden onderzocht. Dit medicijn heeft inderdaad een andere chemische structuur dan die van fingolimod, een binding die beperkt is tot S1P1- en S1P5-receptoren versus S1P1, S1P3, S1P4 en S1P5 van fingolimod, verschillende farmacokinetiek en kortere eliminatiehalfwaardetijd (Chun et al., 2021 ).

Het doel van dit specifieke doel is het evalueren, in ex vivo modellen van de menselijke BBB die worden geëxploiteerd door middel van transwell-gebaseerde systemen en organoïden, van de effecten van ozanimod op: i) het behoud van de integriteit van de BBB in een context van cytokine-gemedieerde barrière-afbraak; ii) het belemmeren van de migratie van T-cellen en NK-cellen over BBB.

De ex-vivo blootstelling van mononucleaire cellen in het perifere bloed (PBMC's) van MS-patiënten aan ozanimod zal naar verwachting de schade aan de BBB die wordt gemedieerd door pro-inflammatoire cytokines verminderen, evenals het vermogen van deze immuuncellen in de hele BBB verminderen. PBMC's van patiënten met NMOSD's zullen ook worden gebruikt als ontstekingscontrole, aangezien bij deze aandoeningen Th17-cellen een belangrijke pathogenetische rol spelen, samen met de op BBB gerichte AQP-4-antilichamen.

AIM3: het vermogen van ozanimod om de migratie-eigenschappen van met het Epstein-Barr-virus (EBV) geïnfecteerde B-cellen in MS te beïnvloeden (Sant'Andrea Hospital).

In de algemene populatie bleek de geheugensubset van B-lymfocyten, die tijdens therapie met S1P-receptormodulatoren verminderde, degene te zijn die selectief EBV herbergt als een latent infecterend middel. Verschillende onderzoeken naar EBV-genotypes toonden een verband aan tussen specifieke genvarianten van Epstein-Barr nucleair antigeen 2 (EBNA2) en MS. EBNA2 werkt als een transactivator op zowel virale als cellulaire genpromotors/enhancers door verplichte interacties met gastheerceltranscriptiefactoren. Rekening houdend met het complexe samenspel tussen EBNA2 en cellulaire componenten, is het waarschijnlijk dat EBNA2-varianten de processen van vroege infectie kunnen beïnvloeden en kunnen deelnemen aan de ontregelde virus-gastheer-interacties bij MS. Ook lijken MS-geassocieerde EBNA2-varianten de migratie en rijping van B-cellen in kiemcentra te verstoren. Ondanks dat de aanwezigheid van EBV-infectie in de MS-hersenen controversieel is, ondersteunen sommige waarnemingen het bewijs van een intrathecale reactivering en virusgestuurde immunopathogene respons bij MS. De hypothese van dit specifieke doel is dat ozanimod immunomodulerende effecten kan hebben op B-cellen en EBV-geïnfecteerde cellen in een MS-context. Zoals eerder vermeld, is ozanimod een krachtige S1P1R-modulator, die de uittreding van lymfocyten uit lymfoïde weefsels remt. B-cellen en lymfoblastoïde cellijnen [spontaan ontgroeiend (spLCLs) of in vitro geïnfecteerd met de EBV-laboratoriumstam B95.8 (95.8LCLs)], zullen worden gebruikt om te bestuderen hoe EBV-infectie de migratiecapaciteit beïnvloedt en hoe deze capaciteit wordt beïnvloed door ozanimod.

Concreet zal het volgende aspect worden onderzocht: i) de migratie-eigenschappen van B-cellen, spLCL's en B95.8LCL's van MS-patiënten en gezonde donoren (HD) van dezelfde leeftijd en geslacht; ii) of ozanimod in staat is de migratie-eigenschappen van de bovengenoemde cellen van patiënten en ZvH te moduleren.

De kennis van de invloed van ozanimod op B-cellen en de migratie van EBV-geïnfecteerde B-cellen door lymfoïde organen en zelfs in de hersenen zal door dit onderzoek aanzienlijk worden verbeterd.

AIM4: het vermogen van ozanimod om het aantal en/of de functie van regulerende T-cellen (Treg) te moduleren, een lymfocytenpopulatie die een sleutelrol speelt bij de controle van auto-immuunreacties (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Napels, Italië, ontvangt bloedmonsters van het Neuromed-ziekenhuis en het Sant'Andrea-ziekenhuis; geen rekruteringseenheid). Intracellulaire metabole routes zijn in staat om de inductie en functie van verschillende cellulaire subsets van het immuunsysteem te regelen, glycolyse is inderdaad onmisbaar voor het genereren van menselijke iTreg-cellen uit Tconv-cellen. Bovendien was een glycolytisch defect tijdens de activering van Tconv-cellen bij MS- ​​en T1D-patiënten geassocieerd met een verminderde inductie en onderdrukkende functie van iTreg-cellen bij deze patiënten, wat duidt op een defecte functie van iTreg-cellen tijdens auto-immuniteit. Het effect van ozanimod op het cellulair metabolisch profiel van T-lymfocyten en van iTreg-cellen zal worden onderzocht. Dit specifieke doel zal in het bijzonder evalueren i) het vermogen van ozanimod om de functie/activiteit van T-cellen en iTreg-cellen te beïnvloeden (activering, proliferatie, onderdrukking, Foxp3-inductie) en ii) het metabole vermogen van circulerende T-celpopulaties (d.w.z. meting van glycolyse en oxidatieve fosforylering) gezuiverd van gezonde proefpersonen en MS-patiënten.

Van Ozanimod wordt verwacht dat het het immunometabolisme van Tconv- en iTreg-cellen bij RRMS-patiënten kan reguleren. Dit doel zal ook beoordelen of ozanimod in staat is om de inductie van iTreg-cellen bij gezonde controles en RRMS-patiënten te wijzigen.