Effekter af Ozanimod på immunmedierede mekanismer for neurodegeneration ved multipel sklerose - en præklinisk undersøgelse

Multipel sklerose (MS) er en multifaktoriel og kompleks sygdom med flere og sammenfiltrede patofysiologiske mekanismer, der er ansvarlige for den inflammatoriske og neurodegenerative skade. Behandlinger rettet mod inflammatoriske veje har bragt betydelige fremskridt i behandlingen af ​​MS med recidiverende remittering. Skuffende nok er virkningen af ​​disse behandlinger på neurodegeneration begrænset. For at tackle problemets kompleksitet kan kombinationsbehandlinger være nødvendige. Sikkerhed, tolerabilitet og omkostninger har dog indtil videre begrænset denne mulighed. Enkeltbehandlinger, der på én gang retter sig mod inflammation og neurodegeneration, er et tiltalende alternativ. Imidlertid er en omfattende forståelse af deres virkninger afgørende for at maksimere deres effekt.

Ozanimod er et molekyle, der er rettet mod inflammation og neurodegeneration på samme tid. Dets indvirkning på sidstnævnte er mindre godt forstået. Lægemidlet frembringer sine virkninger ved at virke på to (S1P1 og S1P5) af de fem sphingosin-1-phosphat G-proteinkoblede receptorundertyper. Mens de molekylære mål for lægemidlet er præcist defineret, er der stadig meget at lære om de mange biologiske effekter, der kan følge receptorernes modulering.

En samarbejdsbaseret og integreret tilgang foreslås for at uddybe vores forståelse af ozanimods virkninger på den komplekse patofysiologi af MS.

Forskningen vil fokusere på afgørende aspekter for MS-biologi. Specifikt vil det blive undersøgt, hvordan ozanimod kan kontrastere neurodegenerative mekanismer udløst af begge arme af det adaptive immunrespons (T- og B-celler) og af deres suboptimale regulering i MS. Overordnet sigter projektet på at undersøge:

AIM1: ozanimods evne til at modulere den synaptotoksiske effekt af T-celler afledt af aktive MS-patienter i en MS-kimær ex-vivo-model og til at identificere mulige mediatorer (IRCCS Neuromed-Pozzilli, i samarbejde med Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Systems Medicine, Tor Vergata Universitet i Rom). Inflammatorisk synaptopati, nemlig synapsetab og synaptisk dysfunktion, dukker op som et vigtigt kendetegn for gråstofpatologi i MS og dens musemodel eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE). I de seneste år er der blevet tilvejebragt beviser for en direkte rolle for T-celler, afledt af MS-patienter eller EAE-mus, i at inducere glutamat-medieret excitotoksicitet, en fremtrædende form for synaptopati påvist i MS/EAE-hjernen. Især indikerer adskillige beviser, at begrænsning af glutamat-excitotoksicitet er en attraktiv terapeutisk strategi til behandling af MS.

For nylig blev de modulerende virkninger af ozanimod på inflammatorisk glutamat-medieret excitotoksicitet undersøgt, og den forskellige involvering af sphingosinreceptorundertyper (S1P1 og S1P5) blev evalueret i EAE-modellen. To hovedresultater viste sig: For det første har S1P1/S1P5-modulatoren ozanimod centrale neurobeskyttende virkninger, der sandsynligvis medieres af en virkning på mikrogliaceller og infiltrerende lymfocytter, hvilket resulterer i en reduceret frigivelse af proinflammatoriske cytokiner, de vigtigste spillere inden for inflammatorisk synaptopati. For det andet viste den centrale levering af en selektiv S1P1-modulator neurobeskyttende virkninger i form af både EAE klinisk score og inflammatorisk synaptopati, hvilket tyder på en primær involvering af denne receptorsubtype i ozanimod-induceret neurobeskyttelse også i MS.

I dette projekt vil MS-kimæriske ex-vivo-model, der for nylig er udviklet i Tor Vergata Universitys laboratorium, blive brugt. T-celler isoleret fra aktive recidiverende remitterende MS-patienter, men ikke fra ikke-aktive (naMS) og raske individer (HS), inducerede en stigning i de spontane glutamaterge strømme, der minder om ændringerne induceret af EAE T-celler.

I dette specifikke formål med projektet vil følgende aspekt blive vurderet: i) at undersøge om ozanimod er i stand til at modulere den synaptotoksiske effekt af T dell afledt af aktive MS-patienter i den MS-kimære ex-vivo model og ii) at identificere sphingosinreceptorundertyper og iii) opløselige molekyler, der potentielt er involveret.

En rolle for ozanimod i at dæmpe excitotoksiske skader forårsaget af synaptotoksiske T-celler, der cirkulerer i MS-hjernen, forventes at blive afsløret, uafhængigt af en forebyggelse af T-cellehandel.

AIM2: ozanimods evne til at reducere den cytokin-medierede nedbrydning af BBB og migrationen af ​​de her undersøgte immunceller gennem ex vivo-modeller af BBB (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). B- og T-lymfocytter og NK-celler er involveret i MS-patogenese (Lassmann, 2019). De bruger forskelligt S1P1- og S1P5-receptorer til at regulere deres trafik på tværs af sekundære lymfoide væv og til at komme ind i CNS gennem BBB (Sallusto et al., 2012). Til gengæld er disse receptorer vigtige for at bevare integriteten og genskabe funktionen af ​​BBB (Chun 2021).

Modulatorer af S1P1- og S1P5-receptorer anvendes i vid udstrækning til behandling af MS, men deres virkningsmekanisme er kun delvist kendt på grund af de komplekse nedstrømseffekter af de kombinerede interaktioner mellem receptorer lokaliseret på membranoverflader af immunceller og ved endotelceller og podocytter af BBB. Disse modulerende egenskaber er hovedsageligt blevet undersøgt for fingolimod, det første lægemiddel af denne klasse, der anvendes i MS, hvorimod ozanimods virkningsmekanismer kræver dybtgående undersøgelser. Faktisk har dette lægemiddel en kemisk struktur forskellig fra den for fingolimod, en binding begrænset til S1P1- og S1P5-receptorer vs. S1P1, S1P3, S1P4 og S1P5 af fingolimod, forskellig farmakokinetik og kortere eliminationshalveringstid (Chun et al., 2021) ).

Formålet med dette specifikke mål er at evaluere in vivo-modeller af den menneskelige BBB udnyttet gennem transwell-baserede systemer og organoider, virkningerne af ozanimod på: i) opretholdelse af BBB-integritet i en sammenhæng med cytokin-medieret barriere-nedbrydning; ii) svække migrationen af ​​T-celler og NK-celler på tværs af BBB.

Ex-vivo eksponeringen af ​​perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) fra MS-patienter til ozanimod forventes at reducere skaden af ​​BBB medieret af pro-inflammatoriske cytokiner, samt at mindske evnen af ​​disse immunceller på tværs af BBB. PBMC'er fra patienter med NMOSD'er vil også blive brugt som inflammatoriske kontroller, da Th17-celler i disse lidelser har en stor patogenetisk rolle sammen med BBB-målrettede AQP-4-antistoffer.

AIM3: ozanimods evne til at påvirke migrationsegenskaberne af Epstein-Barr-virus (EBV) inficerede B-celler i MS (Sant'Andrea Hospital).

I den generelle befolkning er hukommelsesundergruppen af ​​B-lymfocytter, som viste sig at være nedsat under behandling med S1P-receptormodulatorer, den, der selektivt huser EBV som et latent inficerende middel. Adskillige undersøgelser af EBV-genotyper viste en associering af specifikke Epstein-Barr nuklear antigen 2 (EBNA2) genvarianter med MS. EBNA2 virker som en transaktivator på både virale og cellulære genpromotorer/forstærkere ved obligatoriske interaktioner med værtscelle-transskriptionsfaktorer. Når man tager det komplekse samspil mellem EBNA2 og cellulære komponenter i betragtning, er det sandsynligt, at EBNA2-varianter kan påvirke processerne med tidlig infektion og deltage i de dysregulerede virus-vært-interaktioner i MS. MS-associerede EBNA2-varianter synes også at interferere med B-cellemigration og modning i germinale centre. På trods af, at tilstedeværelsen af ​​EBV-infektion i MS-hjernen er kontroversiel, understøtter nogle observationer tegn på en intratekal reaktivering og virus-drevet immunopatogent respons i MS. Hypotesen for dette specifikke mål er, at ozanimod kan have immunmodulerende virkninger på B-celler og EBV-inficerede celler i en MS-sammenhæng. Som allerede nævnt er ozanimod en potent S1P1R-modulator, der hæmmer udgangen af ​​lymfocytter fra lymfoidt væv. B-celler og lymfoblastoide cellelinjer [spontant udvoksende (spLCL'er) eller in vitro inficeret med EBV-laboratoriestammen B95.8 (95.8LCL'er)], vil blive brugt til at undersøge, hvordan EBV-infektion påvirker migrationskapaciteten, og hvordan denne kapacitet påvirkes af ozanimod.

Specifikt vil følgende aspekt blive undersøgt: i) migrationsegenskaberne af B-celler, spLCL'er og B95.8LCL'er fra MS-patienter og alders- og kønsmatchede raske donorer (HD); ii) hvis ozanimod er i stand til at modulere migrationsegenskaberne af ovennævnte celler fra patienter og HS.

Viden om ozanimods indflydelse på B-celler og EBV-inficerede B-cellers migration gennem lymfoide organer og endda i hjernen vil blive væsentligt forbedret af denne forskning.

AIM4: ozanimods evne til at modulere antallet og/eller funktionen af ​​regulatoriske T-celler (Treg), en lymfocytpopulation, der spiller en nøglerolle i kontrollen af ​​autoimmune responser (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Napoli, Italien, modtager blodprøver fra Neuromed Hospital og Sant'Andrea Hospital; ikke rekrutteringsenhed). Intracellulære metaboliske veje er i stand til at kontrollere induktionen og funktionen af ​​forskellige immuncellulære undergrupper, glykolyse er faktisk uundværlig for genereringen af ​​humane iTreg-celler fra Tconv-celler. Derudover var en glykolytisk defekt under aktiveringen af ​​Tconv-celler i MS- og T1D-personer forbundet med en reduceret induktion og undertrykkende funktion af iTreg-celler hos disse patienter, hvilket tyder på en defekt funktion af iTreg-celler under autoimmunitet. Effekten af ​​ozanimod på den cellulære metaboliske profil af T-lymfocytter og iTreg-celler vil blive undersøgt. Dette specifikke mål vil især evaluere i) ozanimods evne til at påvirke T-celle- og iTreg-cellefunktion/aktivitet (aktivering, proliferation, suppression, Foxp3-induktion) og ii) det metaboliske aktiv i cirkulerende T-cellepopulationer (dvs. måling af glykolyse og oxidativ phosphorylering) renset fra raske forsøgspersoner og MS-patienter.

Ozanimod forventes at være i stand til at kontrollere immunmetabolismen af ​​Tconv- og iTreg-celler hos RRMS-patienter. Dette mål vil også vurdere, om ozanimod er i stand til at modificere induktionen af ​​iTreg-celler hos raske kontroller og RRMS-patienter.