Efectos de Ozanimod sobre los mecanismos inmunomediados de neurodegeneración en la esclerosis múltiple: un estudio preclínico

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad multifactorial y compleja con varios y enmarañados mecanismos fisiopatológicos, responsables del daño inflamatorio y neurodegenerativo. Las terapias dirigidas a las vías inflamatorias han supuesto un progreso sustancial en el tratamiento de la EM remitente-recurrente. Lamentablemente, el impacto de estos tratamientos en la neurodegeneración es limitado. Para abordar la complejidad del problema, pueden ser necesarias terapias combinadas. Sin embargo, los problemas de seguridad, tolerabilidad y costo hasta ahora han limitado esta opción. Las terapias individuales que se dirigen a la vez a la inflamación y la neurodegeneración son una alternativa atractiva. Sin embargo, una comprensión integral de sus efectos es esencial para maximizar su impacto.

Ozanimod es una molécula que ataca simultáneamente la inflamación y la neurodegeneración. Su impacto en este último es menos conocido. El fármaco produce sus efectos al actuar sobre dos (S1P1 y S1P5) de los cinco subtipos de receptores acoplados a proteína G de esfingosina-1-fosfato. Si bien los objetivos moleculares del fármaco están definidos con precisión, queda mucho por aprender sobre los muchos efectos biológicos que pueden seguir a la modulación de los receptores.

Se propone un enfoque colaborativo e integrado para profundizar nuestra comprensión de los efectos de ozanimod en la fisiopatología compleja de la EM.

La investigación se centrará en aspectos cruciales para la biología de la EM. Específicamente, se investigará cómo ozanimod puede contrastar los mecanismos neurodegenerativos desencadenados por ambos brazos de la respuesta inmune adaptativa (células T y B) y por su regulación subóptima en la EM. En general, el proyecto tiene como objetivo investigar:

AIM1: capacidad de ozanimod para modular el efecto sinaptotóxico de las células T derivadas de pacientes con EM activa en un modelo ex vivo de EM quimérica y para identificar posibles mediadores (IRCCS Neuromed-Pozzilli, en colaboración con Synaptic Immunopatology Laboratory Dep. Medicina de Sistemas, Universidad Tor Vergata de Roma). La sinaptopatía inflamatoria, es decir, la pérdida de sinapsis y la disfunción sináptica, está emergiendo como un sello importante de la patología de la materia gris en la EM y su modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones. En los últimos años, se ha proporcionado evidencia de un papel directo de las células T, derivadas de pacientes con EM o ratones con EAE, en la inducción de excitotoxicidad mediada por glutamato, una forma prominente de sinaptopatía detectada en el cerebro con EM/EAE. En particular, varias líneas de evidencia indican que limitar la excitotoxicidad del glutamato es una estrategia terapéutica atractiva para tratar la EM.

Recientemente, se investigaron los efectos moduladores de ozanimod sobre la excitotoxicidad inflamatoria mediada por glutamato y se evaluó la diferente participación de los subtipos de receptores de esfingosina (S1P1 y S1P5) en el modelo EAE. Surgieron dos resultados principales: primero, el modulador de S1P1/S1P5 ozanimod tiene efectos neuroprotectores centrales probablemente mediados por una acción sobre las células de la microglía y los linfocitos infiltrantes, lo que resulta en una liberación reducida de citoquinas proinflamatorias, los principales actores de la sinaptopatía inflamatoria. En segundo lugar, la administración central de un modulador selectivo de S1P1 mostró efectos neuroprotectores, tanto en términos de puntuación clínica de EAE como de sinaptopatía inflamatoria, lo que sugiere una participación primaria de este subtipo de receptor en la neuroprotección inducida por ozanimod también en la EM.

En el presente proyecto, se utilizará el modelo ex-vivo quimérico MS desarrollado recientemente en el laboratorio de la Universidad Tor Vergata. Las células T aisladas de pacientes con EM remitente recurrente activa pero no de sujetos no activos (naMS) y sanos (HS), indujeron un aumento de las corrientes glutamatérgicas espontáneas, que recuerdan las alteraciones inducidas por las células T de EAE.

En este objetivo específico del proyecto, se evaluará el siguiente aspecto: i) investigar si ozanimod es capaz de modular el efecto sinaptotóxico de T dell derivada de pacientes con EM activa en el modelo MS-quimérico ex-vivo y ii) identificar subtipos de receptores de esfingosina y iii) moléculas solubles potencialmente involucradas.

Se espera que se revele un papel para ozanimod en la amortiguación del daño excitotóxico causado por las células T sinaptotóxicas que circulan en el cerebro con EM, independientemente de la prevención del tráfico de células T.

OBJETIVO 2: capacidad de ozanimod para reducir la degradación de la BHE mediada por citocinas y la migración de las células inmunitarias aquí estudiadas a través de modelos ex vivo de BBB (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). Los linfocitos B y T y las células NK están involucrados en la patogénesis de la EM (Lassmann, 2019). Usan de manera diferencial los receptores S1P1 y S1P5 para regular su tráfico a través de los tejidos linfoides secundarios y para ingresar al SNC a través de la BBB (Sallusto et al., 2012). A su vez, estos receptores son importantes para mantener la integridad y restaurar la función de BBB (Chun 2021).

Los moduladores de los receptores S1P1 y S1P5 se usan ampliamente para tratar la EM, pero su modo de acción solo se conoce parcialmente debido a los complejos efectos aguas abajo de las interacciones combinadas entre los receptores localizados en las superficies de la membrana de las células inmunitarias y en las células endoteliales y podocitos de el BBB. Estas características de modulación se han estudiado principalmente para fingolimod, el primer fármaco de esta clase utilizado en la EM, mientras que los mecanismos de acción de ozanimod necesitan investigaciones en profundidad. De hecho, este fármaco tiene una estructura química diferente a la de fingolimod, una unión restringida a los receptores S1P1 y S1P5 frente a S1P1, S1P3, S1P4 y S1P5 de fingolimod, una farmacocinética diferente y un tiempo de vida media de eliminación más corto (Chun et al., 2021). ).

El propósito de este objetivo específico es evaluar, en modelos ex vivo de la BHE humana explotados a través de organoides y sistemas basados ​​en Transwell, los efectos de ozanimod en: i) el mantenimiento de la integridad de la BBB en un contexto de ruptura de la barrera mediada por citoquinas; ii) deteriorar la migración de células T y células NK a través de BBB.

Se espera que la exposición ex vivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con EM a ozanimod reduzca el daño de la BBB mediado por citocinas proinflamatorias, así como para mitigar la capacidad de estas células inmunitarias a través de la BBB. Las PBMC de pacientes con NMOSD también se utilizarán como controles inflamatorios, ya que en estos trastornos las células Th17 tienen un papel patogénico importante, junto con los anticuerpos AQP-4 dirigidos a BBB.

OBJETIVO 3: capacidad de ozanimod para afectar las propiedades de migración de las células B infectadas por el virus de Epstein-Barr (EBV) en la EM (Hospital Sant'Andrea).

En la población general, el subconjunto de memoria de los linfocitos B, que se demostró disminuido durante la terapia con moduladores de los receptores S1P, es el que alberga selectivamente el VEB como agente infeccioso latente. Varios estudios sobre genotipos de EBV demostraron una asociación de variantes del gen específico del antígeno nuclear 2 de Epstein-Barr (EBNA2) con la EM. EBNA2 actúa como transactivador en promotores/potenciadores de genes virales y celulares mediante interacciones obligatorias con factores de transcripción de la célula huésped. Teniendo en cuenta la compleja interacción entre EBNA2 y los componentes celulares, es probable que las variantes de EBNA2 puedan afectar los procesos de infección temprana y participar en las interacciones virus-huésped desreguladas en la EM. Además, las variantes de EBNA2 asociadas con la EM parecen interferir con la migración y maduración de las células B dentro de los centros germinales. A pesar de que la presencia de infección por EBV en el cerebro con EM es controvertida, algunas observaciones respaldan la evidencia de una reactivación intratecal y una respuesta inmunopatogénica impulsada por el virus en la EM. La hipótesis de este objetivo específico es que ozanimod puede tener efectos inmunomoduladores sobre las células B y las células infectadas por EBV en un contexto de EM. Como ya se mencionó, ozanimod es un potente modulador de S1P1R que inhibe la salida de linfocitos de los tejidos linfoides. Se utilizarán células B y líneas celulares linfoblastoides [que crecen espontáneamente (spLCL) o infectadas in vitro con la cepa de laboratorio de EBV B95.8 (95.8LCL)], para estudiar cómo la infección por EBV afecta la capacidad de migración y cómo ozanimod afecta esta capacidad.

Específicamente, se investigará el siguiente aspecto: i) las propiedades de migración de células B, spLCL y B95.8LCL de pacientes con EM y donantes sanos (HD) de la misma edad y sexo; ii) si ozanimod es capaz de modular las propiedades de migración de las células anteriores de pacientes y HD.

Esta investigación mejorará significativamente el conocimiento de la influencia de ozanimod en las células B y la migración de células B infectadas con EBV a través de los órganos linfoides e incluso en el cerebro.

OBJETIVO 4: capacidad de ozanimod para modular el número y/o la función de las células T reguladoras (Treg), una población de linfocitos que juega un papel clave en el control de las respuestas autoinmunes (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Nápoles, Italia, recibe muestras de sangre del Hospital Neuromed y del Hospital Sant'Andrea; no es una unidad de reclutamiento). Las vías metabólicas intracelulares pueden controlar la inducción y la función de diferentes subconjuntos de células inmunitarias; de hecho, la glucólisis es indispensable para la generación de células iTreg humanas a partir de células Tconv. Además, un defecto glucolítico durante la activación de las células Tconv en sujetos con EM y DT1 se asoció con una inducción reducida y una función supresora de las células iTreg en estos pacientes, lo que sugiere una función defectuosa de las células iTreg durante la autoinmunidad. Se investigará el efecto de ozanimod en el perfil metabólico celular de los linfocitos T y de las células iTreg. En particular, este objetivo específico evaluará i) la capacidad de ozanimod para afectar la función/actividad de las células T y las células iTreg (activación, proliferación, supresión, inducción de Foxp3) y ii) el activo metabólico de las poblaciones de células T circulantes (es decir, medición de la glucólisis y la fosforilación oxidativa) purificada de sujetos sanos y pacientes con EM.

Se espera que Ozanimod pueda controlar el inmunometabolismo de las células Tconv e iTreg en pacientes con EMRR. Este objetivo también evaluará si ozanimod es capaz de modificar la inducción de células iTreg en controles sanos y pacientes con EMRR.