Auswirkungen von Ozanimod auf immunvermittelte Mechanismen der Neurodegeneration bei Multipler Sklerose – eine präklinische Studie

Multiple Sklerose (MS) ist eine multifaktorielle und komplexe Erkrankung mit mehreren verwickelten pathophysiologischen Mechanismen, die für entzündliche und neurodegenerative Schäden verantwortlich sind. Therapien, die auf Entzündungswege abzielen, haben erhebliche Fortschritte bei der Behandlung von schubförmig remittierender MS gebracht. Enttäuschend ist, dass die Wirkung dieser Behandlungen auf die Neurodegeneration begrenzt ist. Um die Komplexität des Problems zu bewältigen, können Kombinationstherapien erforderlich sein. Allerdings schränken Sicherheits-, Verträglichkeits- und Kostenprobleme diese Option bisher ein. Einzeltherapien, die gleichzeitig auf Entzündungen und Neurodegeneration abzielen, sind eine attraktive Alternative. Um ihre Wirkung zu maximieren, ist jedoch ein umfassendes Verständnis ihrer Auswirkungen unerlässlich.

Ozanimod ist ein Molekül, das gleichzeitig Entzündungen und Neurodegeneration bekämpft. Seine Auswirkungen auf Letzteres sind weniger gut verstanden. Das Medikament entfaltet seine Wirkung, indem es auf zwei (S1P1 und S1P5) der fünf Sphingosin-1-Phosphat-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Subtypen einwirkt. Während die molekularen Ziele des Medikaments genau definiert sind, bleibt noch viel über die vielen biologischen Wirkungen zu lernen, die der Modulation der Rezeptoren folgen können.

Es wird ein kollaborativer und integrierter Ansatz vorgeschlagen, um unser Verständnis der Auswirkungen von Ozanimod auf die komplexe Pathophysiologie von MS zu vertiefen.

Die Forschung wird sich auf entscheidende Aspekte der MS-Biologie konzentrieren. Insbesondere wird untersucht, wie Ozanimod neurodegenerativen Mechanismen entgegenwirken kann, die durch beide Arme der adaptiven Immunantwort (T- und B-Zellen) und durch deren suboptimale Regulation bei MS ausgelöst werden. Insgesamt zielt das Projekt darauf ab, Folgendes zu untersuchen:

AIM1: Fähigkeit von Ozanimod, die synaptotoxische Wirkung von T-Zellen, die von aktiven MS-Patienten stammen, in einem MS-chimären Ex-vivo-Modell zu modulieren und mögliche Mediatoren zu identifizieren (IRCCS Neuromed-Pozzilli, in Zusammenarbeit mit Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Systemmedizin, Universität Tor Vergata Rom). Entzündliche Synaptopathie, insbesondere Synapsenverlust und synaptische Dysfunktion, entwickelt sich zu einem wichtigen Kennzeichen der Pathologie der grauen Substanz bei MS und der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) im Mausmodell. In den letzten Jahren wurde nachgewiesen, dass T-Zellen, die von MS-Patienten oder EAE-Mäusen stammen, eine direkte Rolle bei der Auslösung der Glutamat-vermittelten Exzitotoxizität spielen, einer prominenten Form der Synaptopathie, die im MS/EAE-Gehirn festgestellt wurde. Insbesondere deuten mehrere Belege darauf hin, dass die Begrenzung der Glutamat-Exzitotoxizität eine attraktive Therapiestrategie zur Behandlung von MS ist.

Kürzlich wurden die modulatorischen Wirkungen von Ozanimod auf die entzündliche Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität untersucht und die unterschiedliche Beteiligung von Sphingosinrezeptor-Subtypen (S1P1 und S1P5) im EAE-Modell bewertet. Zwei Hauptergebnisse kamen zum Vorschein: Erstens hat der S1P1/S1P5-Modulator Ozanimod zentrale neuroprotektive Wirkungen, die wahrscheinlich durch eine Wirkung auf Mikrogliazellen und infiltrierende Lymphozyten vermittelt werden, was zu einer verringerten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, den Hauptakteuren der entzündlichen Synaptopathie, führt. Zweitens zeigte die zentrale Verabreichung eines selektiven S1P1-Modulators neuroprotektive Wirkungen sowohl im Hinblick auf den klinischen EAE-Score als auch auf die entzündliche Synaptopathie, was auf eine primäre Beteiligung dieses Rezeptorsubtyps an der durch Ozanimod induzierten Neuroprotektion auch bei MS schließen lässt.

Im vorliegenden Projekt wird das kürzlich im Labor der Universität Tor Vergata entwickelte chimäre MS-Ex-vivo-Modell verwendet. T-Zellen, die von Patienten mit aktiver schubförmig remittierender MS isoliert wurden, jedoch nicht von inaktiven (naMS) und gesunden Probanden (HS), induzierten einen Anstieg der spontanen glutamatergen Ströme, der an die durch EAE-T-Zellen induzierten Veränderungen erinnert.

In diesem spezifischen Ziel des Projekts wird der folgende Aspekt bewertet: i) zu untersuchen, ob Ozanimod in der Lage ist, die synaptotoxische Wirkung von T dell, das von aktiven MS-Patienten stammt, im MS-chimären Ex-vivo-Modell zu modulieren und ii) zu identifizieren Sphingosin-Rezeptor-Subtypen und iii) möglicherweise beteiligte lösliche Moleküle.

Es wird erwartet, dass eine Rolle von Ozanimod bei der Dämpfung exzitotoxischer Schäden, die durch im MS-Gehirn zirkulierende synaptotoxische T-Zellen verursacht werden, unabhängig von der Verhinderung des T-Zell-Handels, aufgeklärt wird.

ZIEL2: Fähigkeit von Ozanimod, den Zytokin-vermittelten Abbau der BHS und die Migration der hier untersuchten Immunzellen durch Ex-vivo-Modelle der BHS (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino) zu reduzieren. B- und T-Lymphozyten sowie NK-Zellen sind an der MS-Pathogenese beteiligt (Lassmann, 2019). Sie verwenden unterschiedlich S1P1- und S1P5-Rezeptoren, um ihren Verkehr durch sekundäres Lymphgewebe zu regulieren und über die BHS in das ZNS einzudringen (Sallusto et al., 2012). Diese Rezeptoren wiederum sind wichtig für die Aufrechterhaltung der Integrität und die Wiederherstellung der Funktion der BHS (Chun 2021).

Modulatoren von S1P1- und S1P5-Rezeptoren werden häufig zur Behandlung von MS eingesetzt, ihre Wirkungsweise ist jedoch aufgrund der komplexen nachgelagerten Auswirkungen der kombinierten Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren, die an den Membranoberflächen von Immunzellen sowie an den Endothelzellen und Podozyten lokalisiert sind, nur teilweise bekannt die BBB. Diese modulierenden Eigenschaften wurden hauptsächlich für Fingolimod untersucht, das erste Medikament dieser Klasse, das bei MS eingesetzt wird, während die Wirkmechanismen von Ozanimod eingehender untersucht werden müssen. Tatsächlich hat dieses Medikament eine andere chemische Struktur als Fingolimod, eine auf S1P1- und S1P5-Rezeptoren beschränkte Bindung im Vergleich zu S1P1, S1P3, S1P4 und S1P5 von Fingolimod, eine andere Pharmakokinetik und eine kürzere Eliminationshalbwertszeit (Chun et al., 2021). ).

Der Zweck dieses spezifischen Ziels besteht darin, in Ex-vivo-Modellen der menschlichen BHS, die durch Transwell-basierte Systeme und Organoide genutzt werden, die Auswirkungen von Ozanimod auf Folgendes zu bewerten: i) Aufrechterhaltung der BHS-Integrität im Kontext des Zytokin-vermittelten Barrierenabbaus; ii) Beeinträchtigung der Migration von T-Zellen und NK-Zellen durch die Blut-Hirn-Schranke.

Es wird erwartet, dass die Ex-vivo-Exposition peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) von MS-Patienten mit Ozanimod die durch proinflammatorische Zytokine vermittelte Schädigung der Blut-Hirn-Schranke verringert und die Fähigkeit dieser Immunzellen über die Blut-Hirn-Schranke abschwächt. PBMCs von Patienten mit NMOSDs werden auch als Entzündungskontrolle eingesetzt, da Th17-Zellen bei diesen Erkrankungen zusammen mit den auf die Blut-Hirn-Schranke gerichteten AQP-4-Antikörpern eine wichtige pathogenetische Rolle spielen.

AIM3: Fähigkeit von Ozanimod, die Migrationseigenschaften von mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) infizierten B-Zellen bei MS zu beeinflussen (Sant'Andrea-Krankenhaus).

In der Allgemeinbevölkerung ist die Gedächtnisuntergruppe der B-Lymphozyten, die sich während der Therapie mit S1P-Rezeptor-Modulatoren nachweislich verringert hat, diejenige, die EBV als latent infektiöses Agens selektiv beherbergt. Mehrere Studien zu EBV-Genotypen zeigten einen Zusammenhang spezifischer Genvarianten des Epstein-Barr-Kernantigens 2 (EBNA2) mit MS. EBNA2 fungiert durch obligatorische Wechselwirkungen mit Transkriptionsfaktoren der Wirtszelle als Transaktivator sowohl für virale als auch für zelluläre Genpromotoren/-Enhancer. Unter Berücksichtigung des komplexen Zusammenspiels zwischen EBNA2 und zellulären Komponenten ist es wahrscheinlich, dass EBNA2-Varianten die Prozesse einer frühen Infektion beeinflussen und an den dysregulierten Virus-Wirt-Interaktionen bei MS beteiligt sein können. Außerdem scheinen MS-assoziierte EBNA2-Varianten die Migration und Reifung von B-Zellen innerhalb der Keimzentren zu beeinträchtigen. Obwohl das Vorliegen einer EBV-Infektion im MS-Gehirn umstritten ist, stützen einige Beobachtungen Hinweise auf eine intrathekale Reaktivierung und eine virusbedingte immunpathogene Reaktion bei MS. Die Hypothese dieses spezifischen Ziels ist, dass Ozanimod immunmodulatorische Wirkungen auf B-Zellen und EBV-infizierte Zellen im MS-Kontext haben kann. Wie bereits erwähnt, ist Ozanimod ein starker S1P1R-Modulator, der den Austritt von Lymphozyten aus lymphatischen Geweben hemmt. B-Zellen und lymphoblastoide Zelllinien [spontan auswachsend (spLCLs) oder in vitro infiziert mit dem EBV-Laborstamm B95.8 (95.8LCLs)] werden verwendet, um zu untersuchen, wie sich eine EBV-Infektion auf die Migrationskapazität auswirkt und wie diese Kapazität durch Ozanimod beeinflusst wird.

Konkret wird folgender Aspekt untersucht: i) die Migrationseigenschaften von B-Zellen, spLCLs und B95.8LCLs von MS-Patienten und alters- und geschlechtsangepassten gesunden Spendern (HD); ii) ob Ozanimod in der Lage ist, die Migrationseigenschaften der oben genannten Zellen von Patienten und der Huntington-Krankheit zu modulieren.

Das Wissen über den Einfluss von Ozanimod auf die Migration von B-Zellen und EBV-infizierten B-Zellen durch lymphatische Organe und sogar im Gehirn wird durch diese Forschung erheblich verbessert.

AIM4: Fähigkeit von Ozanimod, die Anzahl und/oder Funktion regulatorischer T-Zellen (Treg) zu modulieren, einer Lymphozytenpopulation, die eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle von Autoimmunreaktionen spielt (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli „Federico II“, Neapel, Italien, erhält Blutproben vom Neuromed Hospital und dem Sant'Andrea Hospital; keine Rekrutierungseinheit). Intrazelluläre Stoffwechselwege sind in der Lage, die Induktion und Funktion verschiedener zellulärer Untergruppen des Immunsystems zu steuern. Tatsächlich ist die Glykolyse für die Erzeugung menschlicher iTreg-Zellen aus Tconv-Zellen unverzichtbar. Darüber hinaus war ein glykolytischer Defekt während der Aktivierung von Tconv-Zellen bei MS- und T1D-Patienten mit einer verringerten Induktion und supprimierenden Funktion von iTreg-Zellen bei diesen Patienten verbunden, was auf eine fehlerhafte Funktion von iTreg-Zellen während der Autoimmunität hindeutet. Die Wirkung von Ozanimod auf das zelluläre Stoffwechselprofil von T-Lymphozyten und iTreg-Zellen wird untersucht. Dieses spezifische Ziel wird insbesondere i) die Fähigkeit von Ozanimod bewerten, die Funktion/Aktivität von T-Zellen und iTreg-Zellen zu beeinflussen (Aktivierung, Proliferation, Unterdrückung, Foxp3-Induktion) und ii) den Stoffwechselwert zirkulierender T-Zellpopulationen (d. h. Messung der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung), gereinigt von gesunden Probanden und MS-Patienten.

Es wird erwartet, dass Ozanimod den Immunmetabolismus von Tconv- und iTreg-Zellen bei RRMS-Patienten kontrollieren kann. Mit diesem Ziel wird auch beurteilt, ob Ozanimod in der Lage ist, die Induktion von iTreg-Zellen bei gesunden Kontrollpersonen und RRMS-Patienten zu modifizieren.