Влияние озанимода на иммуноопосредованные механизмы нейродегенерации при рассеянном склерозе — доклиническое исследование

Рассеянный склероз (РС) является многофакторным и сложным заболеванием с несколькими запутанными патофизиологическими механизмами, ответственными за воспалительные и нейродегенеративные повреждения. Терапия, нацеленная на воспалительные пути, привела к значительному прогрессу в лечении рецидивирующе-ремиттирующего рассеянного склероза. К сожалению, влияние этих методов лечения на нейродегенерацию ограничено. Для решения сложной проблемы может потребоваться комбинированная терапия. Однако вопросы безопасности, переносимости и стоимости до сих пор ограничивали этот вариант. Единичные методы лечения, направленные одновременно на воспаление и нейродегенерацию, являются привлекательной альтернативой. Тем не менее, всестороннее понимание их воздействия имеет важное значение для максимизации их воздействия.

Озанимод — это молекула, которая одновременно воздействует на воспаление и нейродегенерацию. Его влияние на последний менее изучено. Препарат оказывает свое действие, действуя на два (S1P1 и S1P5) из пяти подтипов рецепторов, связанных с G-белком сфингозин-1-фосфата. Хотя молекулярные мишени препарата точно определены, многое еще предстоит узнать о многих биологических эффектах, которые могут следовать за модуляцией рецепторов.

Предлагается совместный и комплексный подход, чтобы углубить наше понимание влияния озанимода на сложную патофизиологию РС.

Исследование будет сосредоточено на важнейших аспектах биологии рассеянного склероза. В частности, будет изучено, как озанимод может противопоставлять нейродегенеративные механизмы, запускаемые обоими ответвлениями адаптивного иммунного ответа (Т- и В-клетки), и их субоптимальной регуляцией при РС. В целом проект направлен на изучение:

AIM1: способность озанимода модулировать синаптотоксический эффект Т-клеток, полученных от пациентов с активным РС, в химерной модели РС ex-vivo и идентифицировать возможные медиаторы (IRCCS Neuromed-Pozzilli, в сотрудничестве с Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Системная медицина, Римский университет Тор Вергата). Воспалительная синаптопатия, а именно потеря синапсов и синаптическая дисфункция, становится важным признаком патологии серого вещества при РС и его модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) на мышах. В последние годы были получены доказательства прямой роли Т-клеток, полученных от пациентов с рассеянным склерозом или мышей с ЭАЭ, в индуцировании опосредованной глутаматом эксайтотоксичности, заметной формы синаптопатии, обнаруженной в головном мозге с рассеянным склерозом/ЭАЭ. Примечательно, что несколько линий доказательств указывают на то, что ограничение эксайтотоксичности глутамата является привлекательной терапевтической стратегией для лечения рассеянного склероза.

Недавно было исследовано модулирующее действие озанимода на воспалительную эксайтотоксичность, опосредованную глутаматом, и было оценено различное участие подтипов рецепторов сфингозина (S1P1 и S1P5) в модели EAE. Появились два основных результата: во-первых, модулятор S1P1/S1P5 озанимод оказывает центральное нейропротекторное действие, вероятно, опосредованное действием на клетки микроглии и инфильтрирующие лимфоциты, что приводит к уменьшению высвобождения провоспалительных цитокинов, основных участников воспалительной синаптопатии. Во-вторых, центральная доставка селективного модулятора S1P1 продемонстрировала нейропротекторные эффекты с точки зрения как клинической оценки EAE, так и воспалительной синаптопатии, предполагая первичное участие этого подтипа рецептора в индуцированной озанимодом нейропротекции также при РС.

В настоящем проекте будет использоваться химерная модель MS ex-vivo, недавно разработанная в лаборатории Университета Тор Вергата. Т-клетки, выделенные от пациентов с активным рецидивирующе-ремиттирующим РС, но не от неактивного (naMS) и здорового субъекта (HS), индуцировали увеличение спонтанных глутаматергических токов, напоминающее изменения, индуцированные Т-клетками EAE.

В этой конкретной цели проекта будет оцениваться следующий аспект: i) исследовать, способен ли озанимод модулировать синаптотоксический эффект T dell, полученный от активных пациентов с РС, в химерной модели РС ex-vivo и ii) идентифицировать подтипы сфингозиновых рецепторов и iii) потенциально вовлеченные растворимые молекулы.

Ожидается, что будет выявлена ​​роль озанимода в ослаблении эксайтотоксического повреждения, вызванного синаптотоксическими Т-клетками, циркулирующими в мозге при рассеянном склерозе, независимо от предотвращения переноса Т-клеток.

AIM2: способность озанимода снижать опосредованное цитокинами разрушение ГЭБ и миграцию изучаемых здесь иммунных клеток через модели ГЭБ ex vivo (поликлиническая больница IRCCS Сан-Мартино). В патогенезе РС участвуют В- и Т-лимфоциты, а также NK-клетки (Lassmann, 2019). Они по-разному используют рецепторы S1P1 и S1P5, чтобы регулировать их трафик через вторичные лимфоидные ткани и проникать в ЦНС через ГЭБ (Sallusto et al., 2012). В свою очередь, эти рецепторы важны для поддержания целостности и восстановления функции ГЭБ (Chun 2021).

Модуляторы рецепторов S1P1 и S1P5 широко используются для лечения РС, но механизм их действия известен лишь частично из-за сложных последующих эффектов комбинированных взаимодействий между рецепторами, локализованными на поверхности мембран иммунных клеток, а также на эндотелиальных клетках и подоцитах ВВВ. Эти модулирующие свойства были в основном изучены для финголимода, первого препарата этого класса, применяемого при РС, тогда как механизмы действия озанимода нуждаются в более глубоком изучении. Действительно, этот препарат имеет химическую структуру, отличную от финголимода, связывание, ограниченное рецепторами S1P1 и S1P5 по сравнению с S1P1, S1P3, S1P4 и S1P5 финголимода, другую фармакокинетику и более короткий период полувыведения (Chun et al., 2021). ).

Цель этой конкретной цели состоит в том, чтобы оценить в моделях ex vivo ГЭБ человека, используемых с помощью трансвелл-систем и органоидов, влияние озанимода на: i) поддержание целостности ГЭБ в контексте опосредованного цитокинами разрушения барьера; ii) нарушение миграции Т-клеток и NK-клеток через ГЭБ.

Ожидается, что ex vivo воздействие озанимода на мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) пациентов с РС уменьшит повреждение ГЭБ, опосредованное провоспалительными цитокинами, а также снизит способность этих иммунных клеток проникать через ГЭБ. PBMC пациентов с NMOSD также будут использоваться в качестве средств контроля воспаления, поскольку при этих заболеваниях клетки Th17 играют основную патогенетическую роль вместе с антителами AQP-4, нацеленными на BBB.

AIM3: способность озанимода влиять на миграционные свойства вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), инфицированных В-клеток при РС (больница Сант-Андреа).

В общей популяции подгруппа памяти В-лимфоцитов, которая, как было доказано, снижается во время терапии модуляторами рецепторов S1P, является той, которая избирательно укрывает EBV как латентный инфекционный агент. Несколько исследований генотипов ВЭБ продемонстрировали связь специфических вариантов гена ядерного антигена Эпштейна-Барра 2 (EBNA2) с РС. EBNA2 действует как трансактиватор как вирусных, так и клеточных промоторов/энхансеров генов за счет обязательных взаимодействий с факторами транскрипции клетки-хозяина. Принимая во внимание сложное взаимодействие между EBNA2 и клеточными компонентами, вполне вероятно, что варианты EBNA2 могут влиять на процессы раннего инфицирования и участвовать в нарушении регуляции взаимодействия вирус-хозяин при РС. Кроме того, связанные с РС варианты EBNA2, по-видимому, мешают миграции и созреванию В-клеток в центрах зародыша. Несмотря на то, что наличие EBV-инфекции в головном мозге РС является спорным, некоторые наблюдения подтверждают доказательства интратекальной реактивации и вирус-зависимого иммунопатогенного ответа при РС. Гипотеза этой конкретной цели состоит в том, что озанимод может оказывать иммуномодулирующее действие на В-клетки и инфицированные ВЭБ клетки в контексте РС. Как уже упоминалось, озанимод является мощным модулятором S1P1R, который ингибирует выход лимфоцитов из лимфоидных тканей. В-клетки и лимфобластоидные клеточные линии [спонтанно перерастающие (spLCL) или инфицированные in vitro лабораторным штаммом EBV B95.8 (95,8LCL)] будут использоваться для изучения того, как инфекция EBV влияет на миграционную способность и как на эту способность влияет озанимод.

В частности, будут исследованы следующие аспекты: i) миграционные свойства В-клеток, spLCL и B95.8LCL от пациентов с РС и здоровых доноров того же возраста и пола (HD); ii) если озанимод способен модулировать миграционные свойства вышеуказанных клеток у пациентов с БХ.

Это исследование значительно расширит знания о влиянии озанимода на миграцию В-клеток и ВЭБ-инфицированных В-клеток через лимфоидные органы и даже в головной мозг.

AIM4: способность озанимода модулировать количество и/или функцию регуляторных Т-клеток (Treg), популяции лимфоцитов, играющих ключевую роль в контроле аутоиммунных реакций (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli «Federico II», Неаполь, Италия, получение образцов крови из больниц Нейромед и Сант-Андреа, а не рекрутинговое отделение). Внутриклеточные метаболические пути способны контролировать индукцию и функцию различных субпопуляций иммунных клеток, действительно, гликолиз необходим для образования клеток iTreg человека из клеток Tconv. Кроме того, гликолитический дефект во время активации клеток Tconv у субъектов с РС и СД1 был связан со сниженной индукционной и супрессорной функцией клеток iTreg у этих пациентов, что свидетельствует о дефектной функции клеток iTreg во время аутоиммунитета. Будет исследовано влияние озанимода на клеточный метаболический профиль Т-лимфоцитов и клеток iTreg. В частности, эта конкретная цель будет оценивать i) способность озанимода влиять на функцию/активность Т-клеток и iTreg-клеток (активация, пролиферация, подавление, индукция Foxp3) и ii) метаболический актив циркулирующих популяций Т-клеток (т.е. измерение гликолиза и окислительного фосфорилирования), очищенных от здоровых людей и больных рассеянным склерозом.

Ожидается, что озанимод сможет контролировать иммунометаболизм клеток Tconv и iTreg у пациентов с РРС. Эта цель также позволит оценить, способен ли озанимод изменять индукцию клеток iTreg у здоровых людей и пациентов с РРС.