Effekter av Ozanimod på immunmedierte mekanismer for nevrodegenerasjon ved multippel sklerose - en preklinisk studie

Multippel sklerose (MS) er en multifaktoriell og kompleks sykdom med flere og sammenfiltrede patofysiologiske mekanismer, ansvarlig for den inflammatoriske og nevrodegenerative skaden. Terapier rettet mot inflammatoriske veier har gitt betydelige fremskritt i behandlingen av residiverende-remitterende MS. Skuffende nok er virkningen av disse behandlingene på nevrodegenerasjon begrenset. For å takle kompleksiteten til problemet kan kombinasjonsbehandlinger være nødvendig. Imidlertid har sikkerhet, tolerabilitet og kostnadsproblemer så langt begrenset denne muligheten. Enkeltbehandlinger som retter seg mot betennelse og nevrodegenerasjon på en gang er et tiltalende alternativ. En omfattende forståelse av effektene deres er imidlertid avgjørende for å maksimere effekten.

Ozanimod er et molekyl som retter seg mot betennelse og nevrodegenerasjon samtidig. Dens innvirkning på sistnevnte er mindre godt forstått. Legemidlet produserer sine effekter ved å virke på to (S1P1 og S1P5) av de fem sfingosin-1-fosfat G-proteinkoblede reseptorsubtypene. Mens de molekylære målene til stoffet er nøyaktig definert, gjenstår det mye å lære om de mange biologiske effektene som kan følge reseptors modulering.

En samarbeidende og integrert tilnærming er foreslått for å utdype vår forståelse av ozanimods effekter på den komplekse patofysiologien til MS.

Forskningen vil fokusere på avgjørende aspekter for MS-biologi. Spesifikt vil det bli undersøkt hvordan ozanimod kan kontrastere nevrodegenerative mekanismer utløst av begge armene til den adaptive immunresponsen (T- og B-celler) og av deres suboptimale regulering i MS. Totalt sett tar prosjektet sikte på å undersøke:

AIM1: ozanimods evne til å modulere den synaptotoksiske effekten av T-celler avledet fra aktive MS-pasienter i en MS-kimær ex-vivo-modell og å identifisere mulige mediatorer (IRCCS Neuromed-Pozzilli, i samarbeid med Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Systems Medicine, Tor Vergata Universitetet i Roma). Inflammatorisk synaptopati, nemlig synapsetap og synaptisk dysfunksjon, dukker opp som et viktig kjennetegn på gråstoffpatologi i MS og dens musemodell eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE). I de siste årene har det blitt gitt bevis for en direkte rolle for T-celler, avledet fra MS-pasienter eller EAE-mus, i å indusere glutamatmediert eksitotoksisitet, en fremtredende form for synaptopati oppdaget i MS/EAE-hjernen. Spesielt indikerer flere bevis at begrensning av glutamat-eksitotoksisitet er en attraktiv terapeutisk strategi for å behandle MS.

Nylig ble de modulerende effektene av ozanimod på inflammatorisk glutamatmediert eksitotoksisitet undersøkt og den forskjellige involveringen av sfingosinreseptorsubtyper (S1P1 og S1P5) ble evaluert i EAE-modellen. To hovedresultater dukket opp: For det første har S1P1/S1P5-modulatoren ozanimod sentrale nevrobeskyttende effekter sannsynligvis mediert av en virkning på mikrogliaceller og infiltrerende lymfocytter, noe som resulterer i redusert frigjøring av proinflammatoriske cytokiner, hovedaktørene innen inflammatorisk synaptopati. For det andre viste den sentrale leveringen av en selektiv S1P1-modulator nevrobeskyttende effekter, når det gjelder både EAE klinisk poengsum og inflammatorisk synaptopati, noe som tyder på en primær involvering av denne reseptorsubtypen i ozanimod-indusert nevrobeskyttelse også i MS.

I dette prosjektet vil MS chimeric ex-vivo-modellen som nylig ble utviklet i Tor Vergata Universitys laboratorium, bli brukt. T-celler isolert fra aktive residiverende remitterende MS-pasienter, men ikke fra ikke-aktive (naMS) og friske personer (HS), induserte en økning av de spontane glutamatergiske strømmene, som minner om endringene indusert av EAE T-celler.

I dette spesifikke målet med prosjektet vil følgende aspekt bli vurdert: i) å undersøke om ozanimod er i stand til å modulere den synaptotoksiske effekten av T dell avledet fra aktive MS-pasienter i den MS-kimære ex-vivo-modellen og ii) å identifisere sfingosinreseptorundertyper og iii) løselige molekyler potensielt involvert.

En rolle for ozanimod i å dempe eksitotoksiske skader forårsaket av synaptotoksiske T-celler som sirkulerer i MS-hjernen, uavhengig av en forebygging av T-cellehandel, forventes å bli avslørt.

AIM2: ozanimods evne til å redusere cytokin-mediert nedbrytning av BBB og migreringen av de her studerte immuncellene gjennom ex vivo-modeller av BBB (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). B- og T-lymfocytter, og NK-celler er involvert i MS-patogenesen (Lassmann, 2019). De bruker forskjellig S1P1- og S1P5-reseptorer for å regulere trafikken deres over sekundært lymfoidvev, og for å gå inn i CNS gjennom BBB (Sallusto et al., 2012). I sin tur er disse reseptorene viktige for å opprettholde integriteten og for å gjenopprette funksjonen til BBB (Chun 2021).

Modulatorer av S1P1- og S1P5-reseptorer er mye brukt til å behandle MS, men deres virkemåte er bare delvis kjent på grunn av de komplekse nedstrømseffektene av de kombinerte interaksjonene mellom reseptorer lokalisert på membranoverflatene til immunceller og ved endotelcellene og podocyttene til BBB. Disse modulerende egenskapene er hovedsakelig studert for fingolimod, det første stoffet i denne klassen brukt i MS, mens ozanimods virkningsmekanismer trenger grundige undersøkelser. Faktisk har dette stoffet en kjemisk struktur som er forskjellig fra den til fingolimod, en binding begrenset til S1P1- og S1P5-reseptorer vs S1P1, S1P3, S1P4 og S1P5 av fingolimod, forskjellig farmakokinetikk og kortere eliminasjonshalveringstid (Chun et al., 2021) ).

Hensikten med dette spesifikke målet er å evaluere, in vivo-modeller av menneskelig BBB utnyttet gjennom transbrønnbaserte systemer og organoider, effekten av ozanimod på: i) opprettholdelse av BBB-integritet i en kontekst av cytokin-mediert barriere-nedbrytning; ii) svekke migrasjonen av T-celler og NK-celler over BBB.

Ex-vivo eksponering av perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra MS-pasienter for ozanimod forventes å redusere skaden av BBB mediert av pro-inflammatoriske cytokiner, samt å redusere evnen til disse immuncellene over BBB. PBMC-er til pasienter med NMOSD-er vil også bli brukt som inflammatoriske kontroller, siden Th17-celler i disse lidelsene har en stor patogenetisk rolle, sammen med BBB-målrettede AQP-4-antistoffer.

AIM3: ozanimods evne til å påvirke migrasjonsegenskapene til Epstein-Barr-virus (EBV) infiserte B-celler i MS (Sant'Andrea Hospital).

I den generelle befolkningen er hukommelsesundergruppen av B-lymfocytter, som viste seg å være redusert under behandling med S1P-reseptormodulatorer, den som selektivt inneholder EBV som et latent infeksjonsmiddel. Flere studier på EBV-genotyper viste en assosiasjon av spesifikke Epstein-Barr nukleært antigen 2 (EBNA2) genvarianter med MS. EBNA2 fungerer som en transaktivator på både virale og cellulære genpromotere/forsterkere ved obligatoriske interaksjoner med vertscelletranskripsjonsfaktorer. Tatt i betraktning det komplekse samspillet mellom EBNA2 og cellulære komponenter, er det sannsynlig at EBNA2-varianter kan påvirke prosessene med tidlig infeksjon og delta i de dysregulerte virus-vert-interaksjonene i MS. MS-assosierte EBNA2-varianter ser også ut til å forstyrre B-celle-migrering og modning i germinale sentre. Til tross for at tilstedeværelsen av EBV-infeksjon i MS-hjernen er kontroversiell, støtter noen observasjoner bevis på en intratekal reaktivering og virusdrevet immunopatogen respons i MS. Hypotesen for dette spesifikke målet er at ozanimod kan ha immunmodulerende effekter på B-celler og EBV-infiserte celler i en MS-kontekst. Som allerede nevnt, er ozanimod en potent S1P1R-modulator, som hemmer utgangen av lymfocytter fra lymfoidvev. B-celler og lymfoblastoide cellelinjer [spontant utvoksende (spLCLs) eller in vitro infisert med EBV laboratoriestammen B95.8 (95.8LCLs)], vil bli brukt for å studere hvordan EBV-infeksjon påvirker migrasjonskapasiteten og hvordan denne kapasiteten påvirkes av ozanimod.

Spesifikt vil følgende aspekt bli undersøkt: i) migrasjonsegenskapene til B-celler, spLCL og B95.8LCL fra MS-pasienter og alders- og kjønnsmatchede friske donorer (HD); ii) hvis ozanimod er i stand til å modulere migrasjonsegenskapene til de ovennevnte cellene fra pasienter og HS.

Kunnskapen om ozanimods innflytelse på B-celler og EBV-infiserte B-cellers migrering gjennom lymfoide organer og til og med i hjernen, vil bli betydelig forbedret av denne forskningen.

AIM4: ozanimods evne til å modulere antall og/eller funksjon av regulatoriske T-celler (Treg), en lymfocyttpopulasjon som spiller en nøkkelrolle i kontrollen av autoimmune responser (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Napoli, Italia, mottar blodprøver fra Neuromed Hospital og Sant'Andrea Hospital; ikke rekrutteringsenhet). Intracellulære metabolske veier er i stand til å kontrollere induksjonen og funksjonen til forskjellige immuncellulære undergrupper, faktisk er glykolyse uunnværlig for generering av humane iTreg-celler fra Tconv-celler. I tillegg var en glykolytisk defekt under aktiveringen av Tconv-celler i MS- og T1D-personer assosiert med en redusert induksjon og undertrykkende funksjon av iTreg-celler hos disse pasientene, noe som tyder på en defekt funksjon av iTreg-celler under autoimmunitet. Effekten av ozanimod på den cellulære metabolske profilen til T-lymfocytter og iTreg-celler vil bli undersøkt. Spesielt vil dette spesifikke målet evaluere i) evnen til ozanimod til å påvirke T-celle- og iTreg-cellefunksjon/aktivitet (aktivering, proliferasjon, undertrykkelse, Foxp3-induksjon) og ii) den metabolske ressursen til sirkulerende T-cellepopulasjoner (dvs. måling av glykolyse og oksidativ fosforylering) renset fra friske personer og MS-pasienter.

Ozanimod forventes å være i stand til å kontrollere immunometabolismen av Tconv- og iTreg-celler hos RRMS-pasienter. Dette målet vil også vurdere om ozanimod er i stand til å modifisere induksjonen av iTreg-celler hos friske kontroller og RRMS-pasienter.