Effetti di Ozanimod sui meccanismi immuno-mediati della neurodegenerazione nella sclerosi multipla: uno studio preclinico

La sclerosi multipla (SM) è una malattia multifattoriale e complessa con molteplici e intricati meccanismi fisiopatologici, responsabili del danno infiammatorio e neurodegenerativo. Le terapie mirate alle vie infiammatorie hanno portato sostanziali progressi nel trattamento della SM recidivante-remittente. Purtroppo, l'impatto di questi trattamenti sulla neurodegenerazione è limitato. Per affrontare la complessità del problema, possono essere necessarie terapie combinate. Tuttavia, i problemi di sicurezza, tollerabilità e costi hanno finora limitato questa opzione. Le singole terapie che mirano contemporaneamente all'infiammazione e alla neurodegenerazione sono un'alternativa allettante. Tuttavia, una comprensione completa dei loro effetti è essenziale per massimizzarne l'impatto.

Ozanimod è una molecola che agisce contemporaneamente su infiammazione e neurodegenerazione. Il suo impatto su quest'ultimo è meno ben compreso. Il farmaco produce i suoi effetti agendo su due (S1P1 e S1P5) dei cinque sottotipi di recettori accoppiati a proteine ​​della sfingosina-1-fosfato G. Mentre i bersagli molecolari del farmaco sono definiti con precisione, resta ancora molto da imparare sui numerosi effetti biologici che possono seguire la modulazione dei recettori.

Viene proposto un approccio collaborativo e integrato per approfondire la nostra comprensione degli effetti di ozanimod sulla complessa fisiopatologia della SM.

La ricerca si concentrerà su aspetti cruciali per la biologia della SM. In particolare, verrà studiato come ozanimod possa contrastare i meccanismi neurodegenerativi innescati da entrambi i rami della risposta immunitaria adattativa (cellule T e B) e dalla loro regolazione subottimale nella SM. Nel complesso, il progetto si propone di indagare:

AIM1: capacità di ozanimod di modulare l'effetto sinaptotossico delle cellule T derivate da pazienti con SM attiva in un modello MS-chimerico ex-vivo e di identificare possibili mediatori (IRCCS Neuromed-Pozzilli, in collaborazione con Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Medicina dei Sistemi, Università di Roma Tor Vergata). La sinaptopatia infiammatoria, vale a dire la perdita di sinapsi e la disfunzione sinaptica, sta emergendo come un importante segno distintivo della patologia della materia grigia nella SM e nel suo modello murino di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Negli ultimi anni, è stata fornita evidenza di un ruolo diretto delle cellule T, derivate da pazienti con SM o topi EAE, nell'indurre l'eccitotossicità mediata dal glutammato, una forma prominente di sinaptopatia rilevata nel cervello con SM/EAE. In particolare, diverse linee di evidenza indicano che limitare l'eccitotossicità del glutammato è una strategia terapeutica interessante per il trattamento della SM.

Recentemente, sono stati studiati gli effetti modulatori di ozanimod sull'eccitotossicità infiammatoria mediata dal glutammato e il diverso coinvolgimento dei sottotipi di recettori della sfingosina (S1P1 e S1P5) è stato valutato nel modello EAE. Sono emersi due risultati principali: in primo luogo, il modulatore S1P1/S1P5 ozanimod ha effetti neuroprotettivi centrali probabilmente mediati da un'azione sulle cellule della microglia e sui linfociti infiltranti, con conseguente ridotto rilascio di citochine proinfiammatorie, i principali attori della sinaptopatia infiammatoria. In secondo luogo, la consegna centrale di un modulatore selettivo S1P1 ha mostrato effetti neuroprotettivi, sia in termini di punteggio clinico EAE che di sinaptopatia infiammatoria, suggerendo un coinvolgimento primario di questo sottotipo di recettore nella neuroprotezione indotta da ozanimod anche nella SM.

Nel presente progetto verrà utilizzato il modello MS chimerico ex-vivo recentemente sviluppato nel laboratorio dell'Università di Tor Vergata. Le cellule T isolate da pazienti con SM attiva recidivante remittente ma non da soggetti non attivi (naMS) e sani (HS), hanno indotto un aumento delle correnti glutamatergiche spontanee, che ricordano le alterazioni indotte dalle cellule T EAE.

In questo specifico obiettivo del progetto, verrà valutato il seguente aspetto: i) indagare se ozanimod è in grado di modulare l'effetto sinaptotossico di T dell derivato da pazienti con SM attiva nel modello MS-chimerico ex-vivo e ii) identificare sottotipi di recettori della sfingosina e iii) molecole solubili potenzialmente coinvolte.

Si prevede che sarà rivelato un ruolo di ozanimod nell'attenuare il danno eccitotossico causato dalle cellule T sinaptotossiche circolanti nel cervello della SM, indipendentemente dalla prevenzione del traffico di cellule T.

OBIETTIVO 2: capacità di ozanimod di ridurre la degradazione citochinica-mediata della BBB e la migrazione delle cellule immunitarie qui studiate attraverso modelli ex vivo di BBB (IRCCS Policlinico Ospedale San Martino). I linfociti B e T e le cellule NK sono coinvolti nella patogenesi della SM (Lassmann, 2019). Usano in modo differenziato i recettori S1P1 e S1P5 per regolare il loro traffico attraverso i tessuti linfoidi secondari e per entrare nel SNC attraverso la BBB (Sallusto et al., 2012). A loro volta, questi recettori sono importanti per mantenere l'integrità e ripristinare la funzione di BBB (Chun 2021).

I modulatori dei recettori S1P1 e S1P5 sono ampiamente utilizzati per il trattamento della SM, ma il loro meccanismo d'azione è solo parzialmente noto a causa dei complessi effetti a valle delle interazioni combinate tra i recettori localizzati sulla superficie delle membrane delle cellule immunitarie e delle cellule endoteliali e dei podociti di il BBB. Queste caratteristiche modulanti sono state studiate principalmente per fingolimod, il primo farmaco di questa classe utilizzato nella SM, mentre i meccanismi d'azione di ozanimod necessitano di indagini approfondite. In effetti, questo farmaco ha una struttura chimica diversa da quella di fingolimod, un legame ristretto ai recettori S1P1 e S1P5 rispetto a S1P1, S1P3, S1P4 e S1P5 di fingolimod, una diversa farmacocinetica e un tempo di dimezzamento di eliminazione più breve (Chun et al., 2021 ).

Lo scopo di questo obiettivo specifico è valutare, in modelli ex vivo della BBB umana sfruttata attraverso sistemi e organoidi basati su transwell, gli effetti di ozanimod su: i) mantenimento dell'integrità della BBB in un contesto di rottura della barriera mediata da citochine; ii) compromettendo la migrazione delle cellule T e delle cellule NK attraverso BBB.

Si prevede che l'esposizione ex vivo delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da pazienti affetti da SM a ozanimod riduca il danno della BBB mediato dalle citochine pro-infiammatorie, oltre a mitigare la capacità di queste cellule immunitarie attraverso la BBB. Le PBMC di pazienti con NMOSDs saranno utilizzate anche come controlli infiammatori, poiché in questi disordini le cellule Th17 hanno un ruolo patogenetico importante, insieme agli anticorpi anti-BBB AQP-4.

AIM3: capacità di ozanimod di influenzare le proprietà di migrazione delle cellule B infettate dal virus di Epstein-Barr (EBV) nella SM (Ospedale Sant'Andrea).

Nella popolazione generale, il sottogruppo di memoria dei linfociti B, dimostratosi ridotto durante la terapia con modulatori dei recettori S1P, è quello che ospita selettivamente l'EBV come agente infettante latente. Diversi studi sui genotipi di EBV hanno dimostrato un'associazione di specifiche varianti del gene dell'antigene nucleare 2 di Epstein-Barr (EBNA2) con la SM. L'EBNA2 agisce come transattivatore sui promotori/potenziatori genici sia virali che cellulari mediante interazioni obbligatorie con i fattori di trascrizione della cellula ospite. Prendendo in considerazione la complessa interazione tra EBNA2 e componenti cellulari, è probabile che le varianti di EBNA2 possano influenzare i processi di infezione precoce e partecipare alle interazioni virus-ospite disregolate nella SM. Inoltre, le varianti EBNA2 associate alla SM sembrano interferire con la migrazione e la maturazione delle cellule B all'interno dei centri germinali. Nonostante la presenza di infezione da EBV nel cervello della SM sia controversa, alcune osservazioni supportano l'evidenza di una riattivazione intratecale e di una risposta immunopatogena guidata dal virus nella SM. L'ipotesi di questo obiettivo specifico è che ozanimod possa avere effetti immunomodulatori sulle cellule B e sulle cellule infette da EBV in un contesto di SM. Come già accennato, ozanimod è un potente modulatore S1P1R, che inibisce l'uscita dei linfociti dai tessuti linfoidi. Le cellule B e le linee cellulari linfoblastoidi [spontaneously outgrowing (spLCLs) o in vitro infettate con il ceppo di laboratorio EBV B95.8 (95.8LCLs)], saranno utilizzate per studiare come l'infezione da EBV influisca sulla capacità di migrazione e come questa capacità sia influenzata da ozanimod.

In particolare, saranno studiati i seguenti aspetti: i) le proprietà di migrazione delle cellule B, spLCL e B95.8LCL da pazienti affetti da SM e da donatori sani (HD) di pari età e sesso; ii) se ozanimod è in grado di modulare le proprietà di migrazione delle suddette cellule da pazienti e HD.

La conoscenza dell'influenza di ozanimod sulle cellule B e sulla migrazione delle cellule B infette da EBV attraverso gli organi linfoidi e persino nel cervello, sarà notevolmente migliorata da questa ricerca.

AIM4: capacità di ozanimod di modulare il numero e/o la funzione delle cellule T regolatorie (Treg), una popolazione linfocitaria che gioca un ruolo chiave nel controllo delle risposte autoimmuni (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Napoli, Italia, ricevendo campioni di sangue dall'Ospedale Neuromed e dall'Ospedale Sant'Andrea; non reclutando unità). Le vie metaboliche intracellulari sono in grado di controllare l'induzione e la funzione di diversi sottoinsiemi cellulari immuni, infatti la glicolisi è indispensabile per la generazione di cellule iTreg umane da cellule Tconv. Inoltre, un difetto glicolitico durante l'attivazione delle cellule Tconv nei soggetti con SM e T1D, è stato associato a una ridotta induzione e funzione soppressiva delle cellule iTreg in questi pazienti, suggerendo una funzione difettosa delle cellule iTreg durante l'autoimmunità. Sarà studiato l'effetto di ozanimod sul profilo metabolico cellulare dei linfociti T e delle cellule iTreg. In particolare, questo obiettivo specifico valuterà i) la capacità di ozanimod di influenzare la funzione/attività delle cellule T e iTreg (attivazione, proliferazione, soppressione, induzione di Foxp3) e ii) l'assetto metabolico delle popolazioni di cellule T circolanti (es. misurazione della glicolisi e della fosforilazione ossidativa) purificati da soggetti sani e pazienti affetti da SM.

Ozanimod dovrebbe essere in grado di controllare l'immunometabolismo delle cellule Tconv e iTreg nei pazienti con SMRR. Questo obiettivo valuterà anche se ozanimod è in grado di modificare l'induzione delle cellule iTreg nei controlli sani e nei pazienti con SMRR.