Efeitos do Ozanimod nos Mecanismos Imunomediados da Neurodegeneração na Esclerose Múltipla - um Estudo Pré-Clínico

A esclerose múltipla (EM) é uma doença multifatorial e complexa com vários e emaranhados mecanismos fisiopatológicos, responsáveis ​​pelo dano inflamatório e neurodegenerativo. As terapias direcionadas às vias inflamatórias trouxeram progressos substanciais no tratamento da EM remitente-recorrente. Infelizmente, o impacto desses tratamentos na neurodegeneração é limitado. Para enfrentar a complexidade do problema, terapias combinadas podem ser necessárias. No entanto, questões de segurança, tolerabilidade e custo até agora limitaram essa opção. As terapias únicas que visam simultaneamente a inflamação e a neurodegeneração são uma alternativa atraente. No entanto, uma compreensão abrangente de seus efeitos é essencial para maximizar seu impacto.

Ozanimod é uma molécula que tem como alvo simultaneamente a inflamação e a neurodegeneração. Seu impacto sobre o último é menos bem compreendido. A droga produz seus efeitos agindo em dois (S1P1 e S1P5) dos cinco subtipos de receptores acoplados à proteína G esfingosina-1-fosfato. Embora os alvos moleculares da droga sejam definidos com precisão, ainda há muito a ser aprendido sobre os muitos efeitos biológicos que podem seguir a modulação dos receptores.

Uma abordagem colaborativa e integrada é proposta para aprofundar nossa compreensão dos efeitos do ozanimod na complexa fisiopatologia da EM.

A pesquisa se concentrará em aspectos cruciais para a biologia da EM. Especificamente, será investigado como o ozanimod pode contrastar os mecanismos neurodegenerativos desencadeados por ambos os braços da resposta imune adaptativa (células T e B) e por sua regulação subótima na EM. No geral, o projeto visa investigar:

AIM1: capacidade do ozanimod de modular o efeito sinaptotóxico de células T derivadas de pacientes com EM ativa em um modelo quimérico de MS ex-vivo e de identificar possíveis mediadores (IRCCS Neuromed-Pozzilli, em colaboração com o Laboratório de Imunopatologia Sináptica Dep. Medicina de Sistemas, Universidade Tor Vergata de Roma). A sinaptopatia inflamatória, ou seja, perda de sinapse e disfunção sináptica, está emergindo como uma marca importante da patologia da substância cinzenta na EM e seu modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) em camundongos. Nos últimos anos, foram fornecidas evidências de um papel direto das células T, derivadas de pacientes com EM ou camundongos EAE, na indução de excitotoxicidade mediada por glutamato, uma forma proeminente de sinaptopatia detectada no cérebro de MS/EAE. Notavelmente, várias linhas de evidência indicam que limitar a excitotoxicidade do glutamato é uma estratégia terapêutica atraente para tratar a EM.

Recentemente, os efeitos modulatórios do ozanimod na excitotoxicidade inflamatória mediada pelo glutamato foram investigados e o diferente envolvimento dos subtipos de receptores de esfingosina (S1P1 e S1P5) foi avaliado no modelo EAE. Emergiram dois resultados principais: primeiro, o modulador S1P1/S1P5 ozanimod tem efeitos neuroprotetores centrais provavelmente mediados por uma ação nas células da micróglia e linfócitos infiltrados, resultando em uma liberação reduzida de citocinas pró-inflamatórias, os principais atores da sinaptopatia inflamatória. Em segundo lugar, a entrega central de um modulador S1P1 seletivo mostrou efeitos neuroprotetores, tanto em termos de pontuação clínica de EAE quanto de sinaptopatia inflamatória, sugerindo um envolvimento primário desse subtipo de receptor na neuroproteção induzida por ozanimod também na EM.

No presente projeto, será utilizado o modelo ex-vivo quimérico MS desenvolvido recentemente no laboratório da Tor Vergata University. Células T isoladas de pacientes com EM remitente recidivante ativa, mas não de indivíduos não ativos (naMS) e saudáveis ​​(HS), induziram um aumento das correntes glutamatérgicas espontâneas, reminiscentes das alterações induzidas pelas células T EAE.

Neste objetivo específico do projeto, o seguinte aspecto será avaliado: i) investigar se o ozanimod é capaz de modular o efeito sinaptotóxico de T dell derivado de pacientes com EM ativa no modelo ex-vivo MS-quimérico e ii) identificar subtipos de receptores de esfingosina e iii) moléculas solúveis potencialmente envolvidas.

Espera-se que seja revelado um papel do ozanimod na atenuação dos danos excitotóxicos causados ​​pelas células T sinaptotóxicas que circulam no cérebro da EM, independentemente da prevenção do tráfico de células T.

AIM2: capacidade do ozanimod para reduzir a degradação mediada por citocinas do BBB e a migração das células imunes aqui estudadas através de modelos ex vivo de BBB (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). Linfócitos B e T e células NK estão envolvidos na patogênese da EM (Lassmann, 2019). Eles usam diferencialmente os receptores S1P1 e S1P5 para regular seu tráfego através dos tecidos linfóides secundários e para entrar no SNC através da BHE (Sallusto et al., 2012). Por sua vez, esses receptores são importantes na manutenção da integridade e na restauração da função da BHE (Chun 2021).

Os moduladores dos receptores S1P1 e S1P5 são amplamente utilizados para tratar a EM, mas seu modo de ação é apenas parcialmente conhecido devido aos complexos efeitos a jusante das interações combinadas entre os receptores localizados nas superfícies da membrana das células imunes e nas células endoteliais e podócitos de o BBB. Essas características moduladoras foram estudadas principalmente para o fingolimod, a primeira droga dessa classe usada na EM, enquanto os mecanismos de ação do ozanimod precisam de investigações aprofundadas. De fato, esta droga tem estrutura química diferente da do fingolimod, uma ligação restrita aos receptores S1P1 e S1P5 vs S1P1, S1P3, S1P4 e S1P5 do fingolimod, farmacocinética diferente e menor tempo de meia-vida de eliminação (Chun et al., 2021 ).

O objetivo deste objetivo específico é avaliar, em modelos ex vivo da BBB humana explorados através de sistemas baseados em transwell e organoides, os efeitos do ozanimod em: i) manutenção da integridade da BBB em um contexto de quebra da barreira mediada por citocinas; ii) prejudicar a migração de células T e células NK através da BBB.

Espera-se que a exposição ex-vivo de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com EM ao ozanimod reduza o dano da BBB mediado por citocinas pró-inflamatórias, bem como mitigue a capacidade dessas células imunes através da BBB. PBMCs de pacientes com NMOSDs também serão usados ​​como controles inflamatórios, uma vez que nesses distúrbios as células Th17 têm um papel patogenético importante, juntamente com os anticorpos AQP-4 direcionados ao BBB.

AIM3: capacidade do ozanimod para afetar as propriedades de migração das células B infectadas pelo vírus Epstein-Barr (EBV) em MS (Sant'Andrea Hospital).

Na população geral, o subconjunto de memória dos linfócitos B, comprovadamente diminuído durante a terapia com moduladores dos receptores S1P, é o que abriga seletivamente o EBV como agente infeccioso latente. Vários estudos sobre genótipos de EBV demonstraram uma associação de variantes específicas do gene do antígeno nuclear 2 de Epstein-Barr (EBNA2) com EM. O EBNA2 atua como um transativador em promotores/intensificadores de genes virais e celulares por interações obrigatórias com fatores de transcrição da célula hospedeira. Levando em consideração a complexa interação entre o EBNA2 e os componentes celulares, é provável que as variantes do EBNA2 possam afetar os processos de infecção precoce e participar das interações vírus-hospedeiro desreguladas na EM. Além disso, as variantes de EBNA2 associadas à MS parecem interferir na migração e maturação das células B nos centros germinativos. Apesar da presença de infecção por EBV no cérebro da EM ser controversa, algumas observações suportam evidências de uma reativação intratecal e resposta imunopatogênica causada por vírus na EM. A hipótese deste objetivo específico é que o ozanimod pode ter efeitos imunomoduladores em células B e células infectadas por EBV em um contexto de EM. Como já mencionado, o ozanimod é um potente modulador do S1P1R, que inibe a saída de linfócitos dos tecidos linfoides. Células B e linhagens de células linfoblastóides [crescimento espontâneo (spLCLs) ou infectadas in vitro com a cepa laboratorial EBV B95.8 (95.8LCLs)] serão usadas para estudar como a infecção por EBV afeta a capacidade de migração e como essa capacidade é afetada pelo ozanimod.

Especificamente, serão investigados os seguintes aspectos: i) as propriedades de migração de células B, spLCLs e B95.8LCLs de pacientes com EM e doadores saudáveis ​​pareados por sexo e idade (HD); ii) se o ozanimod for capaz de modular as propriedades de migração das células acima de pacientes e HD.

O conhecimento da influência do ozanimod nas células B e na migração de células B infectadas por EBV através de órgãos linfóides e até mesmo no cérebro será aprimorado de forma importante por esta pesquisa.

AIM4: capacidade do ozanimod de modular o número e/ou a função das células T reguladoras (Treg), uma população de linfócitos que desempenha um papel fundamental no controle das respostas autoimunes (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Nápoles, Itália, recebendo amostras de sangue do Hospital Neuromed e do Hospital Sant'Andrea; não unidade de recrutamento). As vias metabólicas intracelulares são capazes de controlar a indução e a função de diferentes subconjuntos celulares imunes, de fato a glicólise é indispensável para a geração de células iTreg humanas a partir de células Tconv. Além disso, um defeito glicolítico durante a ativação das células Tconv em indivíduos com EM e DM1 foi associado a uma redução na indução e na função supressiva das células iTreg nesses pacientes, sugerindo uma função defeituosa das células iTreg durante a autoimunidade. O efeito do ozanimod no perfil metabólico celular dos linfócitos T e das células iTreg será investigado. Em particular, este objetivo específico avaliará i) a capacidade do ozanimod de afetar a função/atividade das células T e células iTreg (ativação, proliferação, supressão, indução de Foxp3) e ii) o ativo metabólico das populações de células T circulantes (ou seja, medição da glicólise e fosforilação oxidativa) purificada de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com EM.

Espera-se que o ozanimod seja capaz de controlar o imunometabolismo das células Tconv e iTreg em pacientes com EMRR. Este objetivo também avaliará se o ozanimod é capaz de modificar a indução de células iTreg em controles saudáveis ​​e pacientes com EMRR.