Účinky ozanimodu na imunitně zprostředkované mechanismy neurodegenerace u roztroušené sklerózy - preklinická studie

Roztroušená skleróza (RS) je multifaktoriální a komplexní onemocnění s několika spletitými patofyziologickými mechanismy, které jsou odpovědné za zánětlivé a neurodegenerativní poškození. Terapie zaměřené na zánětlivé dráhy přinesly podstatný pokrok v léčbě relabující-remitující RS. Je zklamáním, že dopad těchto léčebných postupů na neurodegeneraci je omezený. K vyřešení složitosti problému mohou být nezbytné kombinované terapie. Problémy s bezpečností, snášenlivostí a náklady však tuto možnost zatím omezovaly. Jednotlivé terapie, které se zaměřují současně na zánět a neurodegeneraci, jsou přitažlivou alternativou. Pro maximalizaci jejich dopadu je však nezbytné komplexní pochopení jejich účinků.

Ozanimod je molekula, která se zaměřuje současně na zánět a neurodegeneraci. Jeho dopad na posledně jmenované je méně dobře pochopen. Lék vyvolává své účinky působením na dva (S1P1 a S1P5) z pěti podtypů receptorů spřažených s G proteinem sfingosin-1-fosfátu. Zatímco molekulární cíle léku jsou přesně definovány, zbývá se ještě hodně dozvědět o mnoha biologických účincích, které mohou následovat po modulaci receptorů.

Je navržen společný a integrovaný přístup k prohloubení našeho porozumění účinkům ozanimodu na komplexní patofyziologii RS.

Výzkum se zaměří na klíčové aspekty pro biologii RS. Konkrétně bude zkoumáno, jak může ozanimod kontrastovat s neurodegenerativními mechanismy spouštěnými oběma rameny adaptivní imunitní odpovědi (T a B buňky) a jejich suboptimální regulací u RS. Celkově si projekt klade za cíl prozkoumat:

AIM1: schopnost ozanimodu modulovat synaptotoxický účinek T-buněk odvozených od aktivních pacientů s RS v MS-chimérickém ex-vivo modelu a identifikovat možné mediátory (IRCCS Neuromed-Pozzilli, ve spolupráci se Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Systémová medicína, Univerzita Tor Vergata v Římě). Zánětlivá synaptopatie, jmenovitě ztráta synapse a synaptická dysfunkce, se objevuje jako důležitý znak patologie šedé hmoty u RS a jejího myšího modelu experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE). V minulých letech byly poskytnuty důkazy o přímé úloze T buněk pocházejících z pacientů s RS nebo myší EAE při indukci glutamátem zprostředkované excitotoxicity, prominentní formy synaptopatie detekované v mozku MS/EAE. Je pozoruhodné, že několik linií důkazů naznačuje, že omezení glutamátové excitotoxicity je atraktivní terapeutickou strategií pro léčbu RS.

Nedávno byly zkoumány modulační účinky ozanimodu na zánětlivou excitotoxicitu zprostředkovanou glutamátem a bylo hodnoceno různé zapojení subtypů sfingosinových receptorů (S1P1 a S1P5) v modelu EAE. Objevily se dva hlavní výsledky: za prvé, modulátor S1P1/S1P5 ozanimod má centrální neuroprotektivní účinky pravděpodobně zprostředkované působením na mikrogliové buňky a infiltrující lymfocyty, což má za následek snížené uvolňování prozánětlivých cytokinů, hlavních hráčů zánětlivé synaptopatie. Za druhé, centrální podávání selektivního modulátoru S1P1 vykazovalo neuroprotektivní účinky, pokud jde o klinické skóre EAE i zánětlivou synaptopatii, což naznačuje primární zapojení tohoto podtypu receptoru do neuroprotekce vyvolané ozanimodem také u RS.

V tomto projektu bude použit MS chimérický ex-vivo model nedávno vyvinutý v laboratoři Tor Vergata University. T buňky izolované z aktivních pacientů s recidivující remitující RS, ale ne z neaktivních (naMS) a zdravých jedinců (HS), indukovaly zvýšení spontánních glutamátergních proudů, připomínající změny vyvolané EAE T buňkami.

V tomto specifickém cíli projektu bude posuzován následující aspekt: ​​i) prozkoumat, zda je ozanimod schopen modulovat synaptotoxický účinek T dell odvozeného od aktivních pacientů s RS v MS-chimerickém ex-vivo modelu a ii) identifikovat podtypy sfingosinového receptoru a iii) potenciálně zahrnuté rozpustné molekuly.

Očekává se, že bude odhalena role ozanimodu při tlumení excitotoxického poškození způsobeného synaptotoxickými T-buňkami cirkulujícími v mozku RS, nezávisle na prevenci přenosu T-buněk.

AIM2: schopnost ozanimodu snižovat cytokiny zprostředkovaný rozpad BBB a migraci zde studovaných imunitních buněk prostřednictvím ex vivo modelů BBB (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). B a T lymfocyty a NK buňky se účastní patogeneze RS (Lassmann, 2019). Diferenciálně používají receptory S1P1 a S1P5 k regulaci jejich pohybu přes sekundární lymfoidní tkáně a ke vstupu do CNS přes BBB (Sallusto et al., 2012). Tyto receptory jsou zase důležité při udržování integrity a při obnově funkce BBB (Chun 2021).

Modulátory receptorů S1P1 a S1P5 se široce používají k léčbě RS, ale jejich způsob účinku je znám pouze částečně kvůli komplexním následným účinkům kombinovaných interakcí mezi receptory lokalizovanými na povrchu membrán imunitních buněk a na endoteliálních buňkách a podocytech. BBB. Tyto modulační vlastnosti byly studovány hlavně u fingolimodu, prvního léku této třídy používaného u RS, zatímco mechanismy účinku ozanimodu vyžadují hloubkové zkoumání. Tento lék má ve skutečnosti chemickou strukturu odlišnou od struktury fingolimodu, vazbu omezenou na receptory S1P1 a S1P5 oproti S1P1, S1P3, S1P4 a S1P5 fingolimodu, odlišnou farmakokinetiku a kratší poločas eliminace (Chun et al., 2021 ).

Účelem tohoto specifického cíle je vyhodnotit v ex vivo modelech lidského BBB využívaného prostřednictvím systémů založených na transwell a organoidech účinky ozanimodu na: i) udržení integrity BBB v kontextu cytokiny zprostředkovaného rozpadu bariéry; ii) narušení migrace T buněk a NK buněk přes BBB.

Očekává se, že ex-vivo expozice mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) pacientů s RS ozanimodu sníží poškození BBB zprostředkované prozánětlivými cytokiny a také zmírní schopnost těchto imunitních buněk napříč BBB. PBMC pacientů s NMOSD budou také použity jako zánětlivé kontroly, protože u těchto poruch mají hlavní patogenetickou úlohu buňky Th17 spolu s protilátkami AQP-4 cílenými na BBB.

AIM3: schopnost ozanimodu ovlivnit migrační vlastnosti B buněk infikovaných virem Epstein-Barrové (EBV) u RS (Sant'Andrea Hospital).

V obecné populaci je paměťová podskupina B lymfocytů, u které se během terapie modulátory receptorů S1P snížila, ta, která selektivně přechovává EBV jako latentně infekční agens. Několik studií o genotypech EBV prokázalo asociaci specifických variant genu Epstein-Barrův jaderný antigen 2 (EBNA2) s RS. EBNA2 působí jako transaktivátor na virových i buněčných genových promotorech/enhancerech prostřednictvím povinných interakcí s transkripčními faktory hostitelské buňky. Vezmeme-li v úvahu komplexní souhru mezi EBNA2 a buněčnými složkami, je pravděpodobné, že varianty EBNA2 mohou ovlivnit procesy časné infekce a účastnit se dysregulovaných interakcí virus-hostitel u RS. Také se zdá, že varianty EBNA2 spojené s MS interferují s migrací a zráním B buněk v germinálních centrech. Přestože je přítomnost EBV infekce v mozku RS kontroverzní, některá pozorování podporují důkazy o intratekální reaktivaci a virem řízené imunopatogenní odpovědi u RS. Hypotézou tohoto specifického cíle je, že ozanimod může mít imunomodulační účinky na B buňky a buňky infikované EBV v kontextu MS. Jak již bylo zmíněno, ozanimod je silný modulátor S1P1R, který inhibuje odchod lymfocytů z lymfoidních tkání. B buňky a lymfoblastoidní buněčné linie [spontánně vyrůstající (spLCL) nebo in vitro infikované laboratorním kmenem EBV B95.8 (95.8LCL)] budou použity ke studiu, jak infekce EBV ovlivňuje migrační kapacitu a jak je tato kapacita ovlivněna ozanimodem.

Konkrétně bude zkoumán následující aspekt: ​​i) migrační vlastnosti B buněk, spLCL a B95.8LCL od pacientů s RS a zdravých dárců (HD) odpovídajících věku a pohlaví; ii) pokud je ozanimod schopen modulovat migrační vlastnosti výše uvedených buněk od pacientů a HD.

Znalost vlivu ozanimodu na B lymfocyty a migraci B lymfocytů infikovaných EBV lymfoidními orgány a dokonce i v mozku bude tímto výzkumem významně zlepšena.

AIM4: schopnost ozanimodu modulovat počet a/nebo funkci regulačních T buněk (Treg), populace lymfocytů hrajících klíčovou roli v kontrole autoimunitních odpovědí (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Neapol, Itálie, přijímající vzorky krve z nemocnice Neuromed a nemocnice Sant'Andrea; není náborová jednotka). Intracelulární metabolické dráhy jsou schopny řídit indukci a funkci různých imunitních buněčných podskupin, glykolýza je skutečně nepostradatelná pro generování lidských iTreg buněk z Tconv buněk. Kromě toho byl glykolytický defekt během aktivace buněk Tconv u pacientů s RS a T1D spojen se sníženou indukční a supresivní funkcí buněk iTreg u těchto pacientů, což naznačuje defektní funkci buněk iTreg během autoimunity. Bude zkoumán účinek ozanimodu na buněčný metabolický profil T lymfocytů a iTreg buněk. Tento konkrétní cíl vyhodnotí zejména i) schopnost ozanimodu ovlivňovat funkci/aktivitu buněk T a iTreg (aktivace, proliferace, suprese, indukce Foxp3) a ii) metabolické aktivum cirkulujících populací T buněk (tj. měření glykolýzy a oxidativní fosforylace) purifikovaných od zdravých subjektů a pacientů s RS.

Předpokládá se, že Ozanimod bude schopen kontrolovat imunometabolismus buněk Tconv a iTreg u pacientů s RRMS. Tento cíl také posoudí, zda je ozanimod schopen modifikovat indukci iTreg buněk u zdravých kontrol a pacientů s RRMS.