Effekter av Ozanimod på immunförmedlade mekanismer för neurodegeneration vid multipel skleros - en preklinisk studie

Multipel skleros (MS) är en multifaktoriell och komplex sjukdom med flera och trassliga patofysiologiska mekanismer, ansvariga för de inflammatoriska och neurodegenerativa skadorna. Terapier som är inriktade på inflammatoriska vägar har medfört betydande framsteg i behandlingen av skov-remitterande MS. En besvikelse är att effekten av dessa behandlingar på neurodegeneration är begränsad. För att ta itu med problemets komplexitet kan kombinationsbehandlingar vara nödvändiga. Säkerhet, tolerabilitet och kostnadsfrågor har dock hittills begränsat denna möjlighet. Enstaka terapier som på en gång riktar inflammation och neurodegeneration är ett tilltalande alternativ. En övergripande förståelse av deras effekter är dock väsentlig för att maximera deras effekt.

Ozanimod är en molekyl som riktar sig mot inflammation och neurodegeneration samtidigt. Dess inverkan på det senare är mindre välkänd. Läkemedlet ger sina effekter genom att verka på två (S1P1 och S1P5) av de fem sfingosin-1-fosfat G-proteinkopplade receptorsubtyperna. Även om de molekylära målen för läkemedlet är exakt definierade, återstår mycket att lära sig om de många biologiska effekter som kan följa receptorernas modulering.

Ett samarbetande och integrerat tillvägagångssätt föreslås för att fördjupa vår förståelse av ozanimods effekter på den komplexa patofysiologin av MS.

Forskningen kommer att fokusera på avgörande aspekter för MS-biologi. Specifikt kommer det att undersökas hur ozanimod kan kontrastera neurodegenerativa mekanismer som utlöses av båda armarna av det adaptiva immunsvaret (T- och B-celler) och av deras suboptimala reglering i MS. Sammantaget syftar projektet till att undersöka:

AIM1: ozanimods förmåga att modulera den synaptotoxiska effekten av T-celler härledda från aktiva MS-patienter i en MS-chimär ex-vivo-modell och att identifiera möjliga mediatorer (IRCCS Neuromed-Pozzilli, i samarbete med Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. Systems Medicine, Tor Vergata University of Rome). Inflammatorisk synaptopati, nämligen synapsförlust och synaptisk dysfunktion, framträder som ett viktigt kännetecken för gråsubstanspatologi i MS och dess musmodell experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE). Under de senaste åren har bevis tillhandahållits för en direkt roll för T-celler, härledda från MS-patienter eller EAE-möss, för att inducera glutamatmedierad excitotoxicitet, en framträdande form av synaptopati som detekteras i MS/EAE-hjärnan. Särskilt indikerar flera bevis att begränsning av glutamat-excitotoxicitet är en attraktiv terapeutisk strategi för att behandla MS.

Nyligen undersöktes de modulerande effekterna av ozanimod på inflammatorisk glutamatmedierad excitotoxicitet och den olika involveringen av sfingosinreceptorsubtyper (S1P1 och S1P5) utvärderades i EAE-modellen. Två huvudresultat framkom: för det första har S1P1/S1P5-modulatorn ozanimod centrala neuroprotektiva effekter som sannolikt medieras av en verkan på mikrogliaceller och infiltrerande lymfocyter, vilket resulterar i en minskad frisättning av proinflammatoriska cytokiner, huvudaktörerna för inflammatorisk synaptopati. För det andra visade den centrala leveransen av en selektiv S1P1-modulator neuroprotektiva effekter, i termer av både EAE-klinisk poäng och inflammatorisk synaptopati, vilket tyder på en primär involvering av denna receptorsubtyp i ozanimod-inducerad neuroprotektion även i MS.

I detta projekt kommer MS chimära ex-vivo-modellen som nyligen utvecklats i Tor Vergata Universitys labb att användas. T-celler isolerade från aktiva återfallande förlöpande MS-patienter men inte från icke-aktiva (naMS) och friska individer (HS), inducerade en ökning av de spontana glutamaterga strömmarna, vilket påminner om förändringarna inducerade av EAE T-celler.

I detta specifika syfte med projektet kommer följande aspekt att bedömas: i) att undersöka om ozanimod kan modulera den synaptotoxiska effekten av T dell härrörande från aktiva MS-patienter i den MS-chimära ex-vivo-modellen och ii) att identifiera sfingosinreceptorsubtyper och iii) lösliga molekyler som potentiellt är involverade.

En roll för ozanimod i att dämpa excitotoxiska skador orsakade av synaptotoxiska T-celler som cirkulerar i MS-hjärnan, oberoende av ett förhindrande av T-cellshandel, förväntas avslöjas.

AIM2: ozanimods förmåga att minska den cytokinförmedlade nedbrytningen av BBB och migrationen av de här studerade immuncellerna genom ex vivo-modeller av BBB (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). B- och T-lymfocyter och NK-celler är involverade i MS-patogenes (Lassmann, 2019). De använder olika S1P1- och S1P5-receptorer för att reglera sin trafik över sekundära lymfoida vävnader och för att komma in i CNS genom BBB (Sallusto et al., 2012). I sin tur är dessa receptorer viktiga för att bibehålla integriteten och för att återställa funktionen hos BBB (Chun 2021).

Modulatorer av S1P1- och S1P5-receptorer används i stor utsträckning för att behandla MS, men deras verkningsmekanism är endast delvis känd på grund av de komplexa nedströmseffekterna av de kombinerade interaktionerna mellan receptorer lokaliserade vid membranytorna av immunceller och vid endotelcellerna och podocyterna hos BBB. Dessa modulerande egenskaper har huvudsakligen studerats för fingolimod, det första läkemedlet i denna klass som används vid MS, medan ozanimods verkningsmekanismer kräver djupgående undersökningar. Faktum är att detta läkemedel har en kemisk struktur som skiljer sig från den för fingolimod, en bindning begränsad till S1P1- och S1P5-receptorer jämfört med S1P1, S1P3, S1P4 och S1P5 av fingolimod, olika farmakokinetik och kortare halveringstid för eliminering (Chun et al., 2021) ).

Syftet med detta specifika syfte är att utvärdera, in ex vivo-modeller av mänsklig BBB som utnyttjas genom transwellbaserade system och organoider, effekterna av ozanimod på: i) bibehållande av BBB-integritet i ett sammanhang av cytokinmedierad barriärnedbrytning; ii) försämra migrationen av T-celler och NK-celler över BBB.

Ex-vivo exponeringen av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från MS-patienter för ozanimod förväntas minska skadorna på BBB som medieras av pro-inflammatoriska cytokiner, samt att minska förmågan hos dessa immunceller över BBB. PBMC från patienter med NMOSDs kommer också att användas som inflammatoriska kontroller, eftersom Th17-celler i dessa sjukdomar har en stor patogenetisk roll, tillsammans med BBB-riktade AQP-4-antikroppar.

AIM3: ozanimods förmåga att påverka migrationsegenskaperna hos Epstein-Barr-virus (EBV) infekterade B-celler i MS (Sant'Andrea Hospital).

I den allmänna befolkningen är minnesundergruppen av B-lymfocyter, som visade sig minska under terapi med S1P-receptormodulatorer, den som selektivt hyser EBV som ett latent infekterande medel. Flera studier på EBV-genotyper visade ett samband mellan specifika Epstein-Barr nukleära antigen 2 (EBNA2) genvarianter med MS. EBNA2 fungerar som en transaktivator på både virala och cellulära genpromotorer/förstärkare genom obligatoriska interaktioner med värdcellstranskriptionsfaktorer. Med hänsyn till det komplexa samspelet mellan EBNA2 och cellulära komponenter är det troligt att EBNA2-varianter kan påverka processerna för tidig infektion och delta i de dysreglerade virus-värdinteraktionerna i MS. MS-associerade EBNA2-varianter verkar också störa B-cellsmigration och mognad inom germinala centra. Trots att närvaron av EBV-infektion i MS-hjärnan är kontroversiell, stöder vissa observationer bevis på en intratekal reaktivering och virusdrivet immunopatogent svar i MS. Hypotesen för detta specifika syfte är att ozanimod kan ha immunmodulerande effekter på B-celler och EBV-infekterade celler i en MS-kontext. Som redan nämnts är ozanimod en potent S1P1R-modulator, som hämmar utträdet av lymfocyter från lymfoida vävnader. B-celler och lymfoblastoidcellinjer [spontant utväxande (spLCL) eller in vitro infekterade med EBV-laboratoriestammen B95.8 (95.8LCLs)], kommer att användas för att studera hur EBV-infektion påverkar migrationskapaciteten och hur denna kapacitet påverkas av ozanimod.

Specifikt kommer följande aspekt att undersökas: i) migrationsegenskaperna för B-celler, spLCL och B95.8LCL från MS-patienter och ålders- och könsmatchade friska donatorer (HD); ii) om ozanimod kan modulera migrationsegenskaperna för ovanstående celler från patienter och HD.

Kunskapen om ozanimods inverkan på B-celler och EBV-infekterade B-cellers migration genom lymfoida organ och även i hjärnan kommer att förbättras avsevärt av denna forskning.

AIM4: ozanimods förmåga att modulera antalet och/eller funktionen hos regulatoriska T-celler (Treg), en lymfocytpopulation som spelar en nyckelroll i kontrollen av autoimmuna svar (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Neapel, Italien, tar emot blodprover från Neuromed Hospital och Sant'Andrea Hospital; inte rekryterande enhet). Intracellulära metaboliska vägar kan kontrollera induktionen och funktionen av olika immuncellulära undergrupper, glykolys är verkligen oumbärlig för genereringen av mänskliga iTreg-celler från Tconv-celler. Dessutom var en glykolytisk defekt under aktiveringen av Tconv-celler i MS- och T1D-patienter associerad med en minskad induktion och undertryckande funktion av iTreg-celler hos dessa patienter, vilket tyder på en defekt funktion av iTreg-celler under autoimmunitet. Effekten av ozanimod på den cellulära metaboliska profilen för T-lymfocyter och iTreg-celler kommer att undersökas. I synnerhet kommer detta specifika mål att utvärdera i) ozanimods förmåga att påverka T-cells- och iTreg-cellsfunktion/aktivitet (aktivering, proliferation, suppression, Foxp3-induktion) och ii) den metaboliska tillgången hos cirkulerande T-cellspopulationer (dvs. mätning av glykolys och oxidativ fosforylering) renat från friska försökspersoner och MS-patienter.

Ozanimod förväntas kunna kontrollera immunometabolismen av Tconv- och iTreg-celler hos RRMS-patienter. Detta syfte kommer också att bedöma om ozanimod kan modifiera induktionen av iTreg-celler hos friska kontroller och RRMS-patienter.