Effets de l'ozanimod sur les mécanismes à médiation immunitaire de la neurodégénérescence dans la sclérose en plaques - une étude préclinique

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie multifactorielle et complexe aux mécanismes physiopathologiques multiples et enchevêtrés, responsable des dommages inflammatoires et neurodégénératifs. Les thérapies ciblant les voies inflammatoires ont apporté des progrès substantiels dans le traitement de la SEP récurrente-rémittente. Malheureusement, l'impact de ces traitements sur la neurodégénérescence est limité. Pour faire face à la complexité du problème, des thérapies combinées peuvent être nécessaires. Cependant, les problèmes de sécurité, de tolérabilité et de coût ont jusqu'à présent limité cette option. Les monothérapies qui ciblent à la fois l'inflammation et la neurodégénérescence sont une alternative intéressante. Cependant, une compréhension globale de leurs effets est essentielle pour maximiser leur impact.

L'ozanimod est une molécule qui cible simultanément l'inflammation et la neurodégénérescence. Son impact sur ces derniers est moins bien connu. Le médicament produit ses effets en agissant sur deux (S1P1 et S1P5) des cinq sous-types de récepteurs couplés à la protéine G sphingosine-1-phosphate. Alors que les cibles moléculaires du médicament sont définies avec précision, il reste beaucoup à apprendre sur les nombreux effets biologiques qui peuvent suivre la modulation des récepteurs.

Une approche collaborative et intégrée est proposée pour approfondir notre compréhension des effets de l'ozanimod sur la physiopathologie complexe de la SEP.

La recherche se concentrera sur des aspects cruciaux pour la biologie de la SEP. Plus précisément, on étudiera comment l'ozanimod peut contraster les mécanismes neurodégénératifs déclenchés par les deux bras de la réponse immunitaire adaptative (cellules T et B) et par leur régulation sous-optimale dans la SEP. Globalement, le projet vise à étudier :

AIM1 : capacité de l'ozanimod à moduler l'effet synaptotoxique des lymphocytes T issus de patients atteints de SEP active dans un modèle ex-vivo chimérique de SEP et à identifier d'éventuels médiateurs (IRCCS Neuromed-Pozzilli, en collaboration avec Synaptic Immunopathology Laboratory Dep. médecine systémique, Université Tor Vergata de Rome). La synaptopathie inflammatoire, à savoir la perte de synapse et le dysfonctionnement synaptique, est en train de devenir une caractéristique importante de la pathologie de la matière grise dans la SEP et son modèle murin d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Au cours des dernières années, des preuves ont été fournies d'un rôle direct des lymphocytes T, dérivés de patients atteints de SEP ou de souris EAE, dans l'induction d'une excitotoxicité médiée par le glutamate, une forme importante de synaptopathie détectée dans le cerveau SEP/EAE. Notamment, plusieurs sources de données indiquent que la limitation de l'excitotoxicité du glutamate est une stratégie thérapeutique intéressante pour traiter la SEP.

Récemment, les effets modulateurs de l'ozanimod sur l'excitotoxicité médiée par le glutamate inflammatoire ont été étudiés et les différentes implications des sous-types de récepteurs de la sphingosine (S1P1 et S1P5) ont été évaluées dans le modèle EAE. Deux résultats principaux ont émergé : premièrement, le modulateur S1P1/S1P5 ozanimod a des effets neuroprotecteurs centraux probablement médiés par une action sur les cellules de la microglie et les lymphocytes infiltrants, entraînant une libération réduite de cytokines pro-inflammatoires, principaux acteurs de la synaptopathie inflammatoire. Deuxièmement, la délivrance centrale d'un modulateur S1P1 sélectif a montré des effets neuroprotecteurs, en termes de score clinique EAE et de synaptopathie inflammatoire, suggérant une implication primaire de ce sous-type de récepteur dans la neuroprotection induite par l'ozanimod également dans la SEP.

Dans le présent projet, le modèle ex-vivo chimérique MS récemment développé dans le laboratoire de l'Université Tor Vergata sera utilisé. Les lymphocytes T isolés de patients atteints de SEP récurrente-rémittente actifs mais pas de sujets non actifs (naMS) et sains (HS), ont induit une augmentation des courants glutamatergiques spontanés, rappelant les altérations induites par les lymphocytes T EAE.

Dans cet objectif spécifique du projet, l'aspect suivant sera évalué : i) étudier si l'ozanimod est capable de moduler l'effet synaptotoxique de T dell dérivé de patients atteints de SEP active dans le modèle ex-vivo MS-chimère et ii) identifier les sous-types de récepteurs de la sphingosine et iii) les molécules solubles potentiellement impliquées.

On s'attend à ce que le rôle de l'ozanimod dans l'atténuation des dommages excitotoxiques causés par les lymphocytes T synaptotoxiques circulant dans le cerveau de la SEP, indépendamment de la prévention du trafic des lymphocytes T, soit révélé.

AIM2 : capacité de l'ozanimod à réduire la dégradation médiée par les cytokines de la BHE et la migration des cellules immunitaires étudiées ici à travers des modèles ex vivo de BHE (IRCCS Polyclinic Hospital San Martino). Les lymphocytes B et T et les cellules NK sont impliqués dans la pathogenèse de la SEP (Lassmann, 2019). Ils utilisent différemment les récepteurs S1P1 et S1P5 pour réguler leur trafic à travers les tissus lymphoïdes secondaires et pour pénétrer dans le SNC par la BHE (Sallusto et al., 2012). À leur tour, ces récepteurs sont importants pour maintenir l'intégrité et restaurer la fonction de la BHE (Chun 2021).

Les modulateurs des récepteurs S1P1 et S1P5 sont largement utilisés pour traiter la SEP, mais leur mode d'action n'est que partiellement connu en raison des effets complexes en aval des interactions combinées entre les récepteurs localisés à la surface des membranes des cellules immunitaires et au niveau des cellules endothéliales et des podocytes de le BBB. Ces propriétés modulatrices ont été principalement étudiées pour le fingolimod, le premier médicament de cette classe utilisé dans la SEP, alors que les mécanismes d'action de l'ozanimod nécessitent des investigations approfondies. En effet, ce médicament a une structure chimique différente de celle du fingolimod, une liaison restreinte aux récepteurs S1P1 et S1P5 vs S1P1, S1P3, S1P4 et S1P5 du fingolimod, une pharmacocinétique différente, et un temps de demi-vie d'élimination plus court (Chun et al., 2021 ).

Le but de cet objectif spécifique est d'évaluer, dans des modèles ex vivo de la BHE humaine exploités par des systèmes et des organoïdes basés sur le transwell, les effets de l'ozanimod sur : i) le maintien de l'intégrité de la BHE dans un contexte de rupture de la barrière médiée par les cytokines ; ii) entraver la migration des lymphocytes T et des cellules NK à travers la BHE.

L'exposition ex vivo des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) des patients atteints de SEP à l'ozanimod devrait réduire les dommages de la BHE médiée par les cytokines pro-inflammatoires, ainsi que pour atténuer la capacité de ces cellules immunitaires à traverser la BHE. Les PBMC de patients atteints de NMOSD seront également utilisés comme témoins inflammatoires, car dans ces troubles, les cellules Th17 ont un rôle pathogénique majeur, ainsi que les anticorps AQP-4 ciblant la BBB.

AIM3 : capacité de l'ozanimod à affecter les propriétés de migration des cellules B infectées par le virus d'Epstein-Barr (EBV) dans la SEP (hôpital Sant'Andrea).

Dans la population générale, le sous-ensemble mémoire des lymphocytes B, qui s'est avéré diminué au cours du traitement par les modulateurs des récepteurs S1P, est celui qui héberge sélectivement l'EBV en tant qu'agent infectieux latent. Plusieurs études sur les génotypes de l'EBV ont démontré une association de variants spécifiques du gène de l'antigène nucléaire 2 d'Epstein-Barr (EBNA2) avec la SEP. EBNA2 agit comme un transactivateur sur les promoteurs/amplificateurs de gènes viraux et cellulaires par des interactions obligatoires avec les facteurs de transcription de la cellule hôte. Compte tenu de l'interaction complexe entre l'EBNA2 et les composants cellulaires, il est probable que les variants de l'EBNA2 puissent affecter les processus d'infection précoce et participer aux interactions dérégulées virus-hôte dans la SEP. De plus, les variants EBNA2 associés à la SEP semblent interférer avec la migration et la maturation des cellules B dans les centres germinatifs. Bien que la présence d'une infection à EBV dans le cerveau de la SEP soit controversée, certaines observations étayent la preuve d'une réactivation intrathécale et d'une réponse immunopathogène induite par le virus dans la SEP. L'hypothèse de cet objectif spécifique est que l'ozanimod peut avoir des effets immunomodulateurs sur les cellules B et les cellules infectées par l'EBV dans un contexte de SEP. Comme déjà mentionné, l'ozanimod est un puissant modulateur S1P1R, qui inhibe la sortie des lymphocytes des tissus lymphoïdes. Les cellules B et les lignées cellulaires lymphoblastoïdes [spontanément excroissantes (spLCL) ou infectées in vitro avec la souche de laboratoire EBV B95.8 (95.8LCL)], seront utilisées pour étudier comment l'infection à EBV affecte la capacité de migration et comment cette capacité est affectée par l'ozanimod.

Plus précisément, l'aspect suivant sera étudié : i) les propriétés de migration des cellules B, des spLCL et des B95.8LCL de patients atteints de SEP et de donneurs sains appariés selon l'âge et le sexe ; ii) si l'ozanimod est capable de moduler les propriétés de migration des cellules ci-dessus des patients et HD.

La connaissance de l'influence de l'ozanimod sur les cellules B et la migration des cellules B infectées par l'EBV à travers les organes lymphoïdes et même dans le cerveau sera considérablement améliorée par cette recherche.

AIM4 : capacité de l'ozanimod à moduler le nombre et/ou la fonction des cellules T régulatrices (Treg), une population de lymphocytes jouant un rôle clé dans le contrôle des réponses auto-immunes (Treg Cell Laboratory, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Naples, Italie, recevant des échantillons de sang de l'hôpital Neuromed et de l'hôpital Sant'Andrea ; pas d'unité de recrutement). Les voies métaboliques intracellulaires sont capables de contrôler l'induction et la fonction de différents sous-ensembles cellulaires immunitaires, en effet la glycolyse est indispensable à la génération de cellules iTreg humaines à partir de cellules Tconv. De plus, un défaut glycolytique lors de l'activation des cellules Tconv chez les sujets SEP et DT1, était associé à une réduction de l'induction et de la fonction suppressive des cellules iTreg chez ces patients suggérant une fonction défectueuse des cellules iTreg au cours de l'auto-immunité. L'effet de l'ozanimod sur le profil métabolique cellulaire des lymphocytes T et des cellules iTreg sera étudié. En particulier, cet objectif spécifique évaluera i) la capacité de l'ozanimod à affecter la fonction/activité des cellules T et des cellules iTreg (activation, prolifération, suppression, induction de Foxp3) et ii) l'actif métabolique des populations de cellules T circulantes (c. mesure de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative) purifiée à partir de sujets sains et de patients atteints de SEP.

L'ozanimod devrait pouvoir contrôler l'immunométabolisme des cellules Tconv et iTreg chez les patients atteints de SEP-RR. Cet objectif évaluera également si l'ozanimod est capable de modifier l'induction des cellules iTreg chez les témoins sains et les patients atteints de SEP-RR.