Moteurs de l'angiogenèse induite par l'hypoxie dans le développement des tumeurs

Contexte Le développement des cellules cancéreuses nécessite une série de capacités acquises pour croître et se propager : 1) autosuffisance en signaux de croissance, 2) insensibilité aux signaux d'inhibition de la croissance, 3) évasion de l'apoptose (mort cellulaire programmée), 4) potentiel réplicatif illimité, 5 ) une angiogenèse soutenue et 6) une invasion tissulaire et des métastases (Hanahan et Weinberg, 2000). L'acquisition de ces capacités est motivée par des mutations dans des oncogènes clés et des gènes suppresseurs de tumeurs, bien que les mécanismes exacts ne soient pas encore entièrement compris. En particulier, l'angiogenèse est cruciale pour la survie d'une cellule car sa multiplication continue dépend de l'oxygène et des nutriments fournis dans le système vasculaire (Hanahan et Weinberg, 2000). L'angiogenèse peut être déclenchée par un manque d'oxygène (hypoxie) et la voie de détection de l'oxygène de la cellule médie une réponse. Dans des conditions normales et en présence d'oxygène, la protéine VHL, pVHL, médie la liaison d'un complexe d'ubiquitine ligase à un groupe de facteurs de transcription appelés facteurs inductibles par l'hypoxie (HIF) et dirige les sous-unités HIF-α vers la dégradation protéosomale. Ainsi, dans les cellules normales avec suffisamment d'oxygène, la transcription induite par HIF-α des gènes cibles est inhibée. Lors de l'hypoxie, le HIF-α n'est pas hydroxylé et n'est donc pas reconnu par la protéine VHL. Les HIF se transloquent vers le noyau et induisent la transcription de nombreux gènes, dont beaucoup codent pour des facteurs angiogéniques qui stimulent la croissance de nouveaux vaisseaux (Maher et al., 2011 ; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). La croissance du cancer nécessite de grandes quantités d'oxygène et la plupart des cellules tumorales sont dans un état constant d'hypoxie.

S'il n'y a pas de pVHL fonctionnel dans une cellule, celle-ci réagit comme si elle avait besoin d'oxygène, car les HIF stimuleront l'angiogenèse indépendamment des niveaux d'oxygène. Par conséquent, les patients présentant des mutations germinales du gène VHL peuvent servir de modèle d'angiogenèse induite par l'hypoxie. Les patients porteurs de mutations germinales du VHL sont atteints de la maladie de von Hippel-Lindaus (vHL) et sont sujets au développement de tumeurs en raison de ce mécanisme, principalement des carcinomes à cellules rénales et des hémangioblastomes du système nerveux central (SNC) (Maher et al., 2011). Même si les hémangioblastomes sont des tumeurs histologiquement bénignes, ils peuvent avoir des conséquences graves. Le développement naturel des hémangioblastomes est caractérisé par des périodes imprévisibles de croissance et de stagnation. Souvent, ils développent des kystes associés qui affectent les tissus nerveux adjacents et provoquent des symptômes massifs, car même de petits changements de volume dans le cerveau peuvent causer des dommages neurologiques graves ou même la mort (Ammerman et al., 2006 ; Glasker et al., 2010 ; Wanebo et al. , 2003).

Les mécanismes à l'origine de la tumorigenèse associée au vHL sont complexes et encore mal compris. Un événement clé est la perte d'un produit protéique VHL fonctionnel à la suite de l'inactivation des deux allèles du gène VHL conformément à l'hypothèse à deux coups de Knudson (Vortmeyer et al., 2013). Cependant, il est également clair que bien que l'inactivation des deux copies du gène VHL d'une personne soit nécessaire, elle ne semble pas suffisante pour le développement de l'hémangioblastome (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004). L'inactivation biallélique du VHL peut être présente sous la forme de plusieurs précurseurs tumoraux dans les tissus prédisposés, et la plupart ne se développent jamais en véritables tumeurs à l'origine de symptômes (Vortmeyer et al., 2013 ; Vortmeyer et al., 2006 ; Vortmeyer et al., 2004).

La question clé pour mieux comprendre comment ralentir ou arrêter le développement tumoral est l'identification des facteurs supplémentaires spécifiques qui initient ou favorisent le développement et la croissance tumorale. Le développement tumoral peut être initié dans une seule cellule qui échappe au contrôle normal de la division cellulaire, mais à mesure que la cellule se divise et se multiplie, les cellules filles passent par une séquence d'événements génétiques multiples dans de nombreux gènes différents qui s'accumulent et confèrent à la tumeur des avantages de croissance ( Hanahan et Weinberg, 2011). Une telle séquence allant de l'adénome bénin au carcinome malin a déjà été cartographiée pour le développement du cancer colorectal et a été d'une immense importance pour notre compréhension actuelle du développement du cancer (Fearon et Vogelstein, 1990). Dans le cas des hémangioblastomes, une connaissance plus approfondie de tout événement génétique commun dans d'autres gènes que le gène VHL qui se produit dans les premiers stades de la progression de l'hémangioblastome aidera à déterminer quels gènes spécifiques peuvent être à l'origine, c'est-à-dire favoriser la croissance et/ou le développement de kystes.

Un groupe a récemment identifié la perte de HNF1B sur le chromosome 17q comme étant un moteur moléculaire potentiel de la tumorigenèse de l'hémangioblastome en utilisant l'analyse de la variation du nombre de copies dans l'ADN tumoral (Sun M et al., 2014). D'autres groupes ont trouvé des preuves que la perte de ZAC1 sur le chromosome 6q joue un rôle majeur dans la tumorigenèse de l'hémangioblastome du SNC associée au vHL et sporadique (Lemeta et al., 2007 ; Zhou et al., 2010). Cependant, des approches plus systématiques étudiant les altérations génétiques des hémangioblastomes dans une perspective plus large pourraient considérablement augmenter notre connaissance de la séquence des événements génétiques menant des précurseurs tumoraux à un stade précoce aux tumeurs complètement développées. Cette connaissance est d'une grande importance, à la fois par rapport à notre compréhension générale de la tumorigenèse, mais aussi par rapport à la détection d'événements génétiques précoces nécessaires qui se produisent dans tous les hémangioblastomes aux premiers stades du développement tumoral et peuvent être à l'origine du processus. Ces événements nécessaires dans les cellules précurseurs tumorales peuvent être utilisés comme biomarqueurs dans les biopsies tissulaires ou les cellules tumorales qui pénètrent dans la circulation sanguine pour déterminer quels patients sont les plus à risque de croissance tumorale agressive. Enfin, les changements dans des gènes spécifiques qui sont connus pour être des étapes clés dans la transformation de précurseurs tumoraux en tumeurs cliniquement significatives seraient des candidats évidents à cibler dans le développement de médicaments anti-tumoraux.

Récemment, des techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont été utilisées avec succès pour déterminer les profils génétiques et la séquence d'événements génétiques spécifiques en relation avec la progression tumorale individuelle dans plusieurs autres types de tumeurs, y compris le carcinome à cellules rénales (RCC) sporadique et associé au vHL (Fisher et al., 2014 ; Gossage et al., 2015 ; Gundem et al., 2015 ; Kroigard et al., 2015). Le NGS permet d'examiner les variations somatiques dans l'ensemble du génome d'une tumeur (c'est-à-dire variations qui se sont développées spécifiquement dans l'ADN de la tumeur et non dans l'ADN germinal du patient (Nik-Zainal, 2014).

Les chercheurs de l'étude ont émis l'hypothèse que différents hémangioblastomes du SNC partagent des altérations génétiques dans des gènes spécifiques qui favorisent ou initient le développement tumoral à partir de cellules déficientes en VHL, c'est-à-dire les moteurs génétiques du développement tumoral. Les chercheurs émettent en outre l'hypothèse que certaines de ces altérations génétiques représentent des étapes dans la séquence de progression de l'hémangioblastome. En comparant les altérations génétiques des tumeurs à différents stades de développement, avec différents schémas de croissance, et avec et sans développement de kystes associés, l'investigateur cherche à élucider les éventuelles altérations génétiques liées au développement qui se produisent dans cette séquence. Sur la base de la fréquence à laquelle les variantes génétiques sont partagées par les tumeurs distinctes, on peut estimer quels gènes sont probablement impliqués à différents stades du développement de l'hémangioblastome. Dans ce projet pilote, les chercheurs prévoient d'analyser des tumeurs distinctes provenant du même patient ainsi que des tumeurs provenant de différents patients pour évaluer les différences intra- et inter-patients.

Les résultats des facteurs génétiques candidats dans ce projet seront ensuite confirmés dans une plus grande série d'hémangioblastomes associés au vHL et sporadiques du SNC, qui seront collectés dans le cadre d'un processus continu. En outre, les chercheurs prévoient de comparer les résultats aux découvertes récentes de facteurs génétiques candidats dans les carcinomes à cellules rénales dans le cadre d'un projet en cours réalisé par certains de nos collaborateurs.

Matériel Les enquêteurs ont identifié des patients vHL danois par le biais de plusieurs registres nationaux de santé et ont demandé aux patients âgés de plus de 18 ans de participer. Les participants consentants ont été interrogés sur leurs antécédents médicaux et les informations vérifiées dans les dossiers médicaux.

Les mutations germinales VHL des participants sont identifiées à l'aide d'ADN extrait d'échantillons de sang périphérique, et pour ce projet pilote, seuls ceux présentant une mutation germinale VHL pathogène identifiable trouvée dans l'ADN des lymphocytes périphériques en utilisant le séquençage direct des exons et des limites exon-intron et MLPA, être compris.

Dans l'étude, des échantillons de tissus de tous les hémangioblastomes du SNC pouvant être obtenus qui ont été enlevés chirurgicalement dans le cadre du traitement d'un participant seront collectés, soit sous forme de tissu inclus en paraffine, soit sous forme de tissu frais congelé, soit sous forme de tissu frais conservé dans de l'ARNlater.

Pour le projet proposé, au moins deux hémangioblastomes du SNC réalisables de chaque participant seront sélectionnés pour une analyse NGS. Les chercheurs s'attendent à pouvoir inclure de l'ADN d'au moins 19 échantillons de tumeurs, y compris de l'ADN extrait à la fois de tissus tumoraux inclus en paraffine, de tissus frais congelés et de tissus en suspension dans de l'ARNlater.

Méthodes L'ADN de chaque participant est isolé du tissu tumoral et du tissu normal (c'est-à-dire sang périphérique) en utilisant des protocoles standards. Le tissu inclus en paraffine peut contenir à la fois du tissu tumoral et du tissu environnant normal. Pour s'assurer que l'ADN du tissu représente l'ADN de la tumeur, les enquêteurs évalueront d'abord les coupes colorées à l'HE et s'assureront que > 85 % de la coupe de tissu contient une tumeur.

L'enrichissement de l'exome de l'ADN tumoral et des tissus normaux sera effectué à l'aide d'un panel Niblegen 64Mb comprenant tous les gènes connus ainsi que les gènes miARN et lincARN. L'ADN enrichi sera séquencé à l'aide de la plate-forme Illumina Hiseq1500 avec un séquençage apparié de 2X100 bases et un taux de couverture moyen de 75-100 x. Les résultats de chaque échantillon d'ADN tumoral seront comparés à l'ADN du tissu normal du patient pour distinguer les variations germinales des altérations génétiques spécifiques à la tumeur et ainsi obtenir le profil des altérations génétiques somatiques appartenant à l'ADN tumoral.

Les mutations somatiques seront identifiées à l'aide d'un logiciel d'appel de variantes somatiques comme VarScan, Mutect, EBCall ou Virmid. Les variantes somatiques identifiées situées dans l'exome de la tumeur seront évaluées et les événements de nombre de copies somatiques seront identifiés grâce au profilage du nombre de copies des données NGS à l'aide des logiciels ngCGH, Contra et Nexus. Les mutations ponctuelles somatiques identifiées seront validées à l'aide d'un séquençage approfondi ciblé. Les chercheurs sélectionneront des régions candidates chromosomiques en fonction de variantes récurrentes dans les tumeurs.

Les caractéristiques cliniques de chaque tumeur avant l'ablation chirurgicale seront évaluées par l'évaluation de données radiologiques en série (IRM du SNC) de la surveillance annuelle de chaque participant et d'examens diagnostiques supplémentaires :

1. Taille de la tumeur : évaluée par le volume de la tumeur (largeur x longueur x hauteur) x 0,5 (mm3)
2. Temps de développement de la tumeur : évalué par l'intervalle de temps entre la première apparition de la tumeur sur l'IRM et le moment de la chirurgie
3. Taux de croissance tumorale : Evalué par progression radiologique, c'est-à-dire évolution du volume tumoral/intervalle de temps entre deux IRM (mois)
4. Phase de croissance de la tumeur : évaluée par quelle phase de croissance se trouvait la tumeur avant la chirurgie (phase de stagnation par rapport à la phase de croissance définie par le changement du volume de la tumeur dans les intervalles de temps entre les trois dernières IRM)
5. Développement de kyste associé et taille du kyste avant la chirurgie : évalué par le volume du kyste lors de la dernière IRM avant la chirurgie.

Ces informations cliniques seront comparées au profil génétique de la tumeur pour évaluer toute association clinique avec d'éventuels moteurs moléculaires.