Aanjagers van door hypoxie geïnduceerde angiogenese bij de ontwikkeling van tumoren

Achtergrond De ontwikkeling van kankercellen vereist een reeks verworven vermogens om te groeien en zich te verspreiden: 1) zelfvoorziening in groeisignalen, 2) ongevoeligheid voor groeiremmingssignalen, 3) omzeiling van apoptose (geprogrammeerde celdood), 4) grenzeloos replicatief potentieel, 5 ) aanhoudende angiogenese en 6) weefselinvasie en metastase (Hanahan en Weinberg, 2000). De verwerving van deze mogelijkheden wordt aangedreven door mutaties in belangrijke oncogenen en tumorsuppressorgenen, hoewel de exacte mechanismen nog niet volledig worden begrepen. Vooral angiogenese is cruciaal voor het overleven van een cel, aangezien de voortgaande vermenigvuldiging ervan afhankelijk is van de zuurstof en voedingsstoffen die in het vaatstelsel worden aangevoerd (Hanahan en Weinberg, 2000). Angiogenese kan worden geïnitieerd door gebrek aan zuurstof (hypoxie), en de zuurstofwaarnemingsroute van de cel medieert een reactie. Onder normale omstandigheden en in aanwezigheid van zuurstof bemiddelt het VHL-eiwit, pVHL, de binding van een ubiquitine-ligasecomplex aan een groep transcriptiefactoren die hypoxie-induceerbare factoren (HIF's) worden genoemd en stuurt de HIF-α-subeenheden naar proteosomale afbraak. Aldus wordt in normale cellen met voldoende zuurstof de door HIF-a geïnduceerde transcriptie van doelgenen geremd. Tijdens hypoxie wordt de HIF-α niet gehydroxyleerd en wordt daarom niet herkend door het VHL-eiwit. De HIF's verplaatsen zich naar de kern en induceren transcriptie van talloze genen, waarvan vele coderen voor angiogene factoren die de groei van nieuwe vaten stimuleren (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). Kankergroei vereist enorme hoeveelheden zuurstof en de meeste tumorcellen bevinden zich in een constante staat van hypoxie.

Als er geen functionele pVHL in een cel is, reageert het alsof het zuurstof nodig heeft, aangezien HIF's angiogenese zullen stimuleren, ongeacht het zuurstofniveau. Daarom kunnen patiënten met kiembaanmutaties in het VHL-gen dienen als een model voor hypoxie-geïnduceerde angiogenese. Patiënten met VHL-mutaties in de kiembaan hebben de ziekte van von Hippel-Lindaus (vHL) en zijn vanwege dit mechanisme vatbaar voor tumorontwikkeling, voornamelijk niercelcarcinoom en hemangioblastomen van het centrale zenuwstelsel (CZS) (Maher et al., 2011). Hoewel hemangioblastomen histologisch goedaardige tumoren zijn, kunnen ze ernstige gevolgen hebben. De natuurlijke ontwikkeling van hemangioblastomen wordt gekenmerkt door onvoorspelbare periodes van groei en stagnatie. Vaak ontwikkelen ze geassocieerde cysten die aangrenzend zenuwweefsel aantasten en enorme symptomen veroorzaken, aangezien zelfs kleine volumeveranderingen in de hersenen ernstige neurologische schade of zelfs de dood kunnen veroorzaken (Ammerman et al., 2006; Glasker et al., 2010; Wanebo et al. , 2003).

De mechanismen achter vHL-geassocieerde tumorgenese zijn complex en nog niet volledig begrepen. Een sleutelgebeurtenis is het verlies van een functioneel VHL-eiwitproduct als gevolg van inactivatie van beide allelen van het VHL-gen in overeenstemming met Knudson's two hit-hypothese (Vortmeyer et al., 2013). Het is echter ook duidelijk dat hoewel inactivering van beide kopieën van iemands VHL-gen noodzakelijk is, dit niet voldoende lijkt te zijn voor de ontwikkeling van hemangioblastoom (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004). Biallelische VHL-inactivatie kan aanwezig zijn in de vorm van meerdere tumorvoorlopers in gepredisponeerde weefsels, en de meeste ontwikkelen zich nooit tot feitelijke symptoomveroorzakende tumoren (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004).

De sleutelvraag voor een beter begrip van hoe tumorontwikkeling kan worden vertraagd of gestopt, is identificatie van welke specifieke aanvullende factoren tumorontwikkeling en -groei initiëren of bevorderen. Tumorontwikkeling kan worden geïnitieerd in een enkele cel die de normale controle over celdeling ontwijkt, maar terwijl de cel zich deelt en vermenigvuldigt, ondergaan de dochtercellen een opeenvolging van meerdere genetische gebeurtenissen in veel verschillende genen die zich ophopen en de tumor groeivoordelen bieden. Hanahan en Weinberg, 2011). Een dergelijke sequentie van goedaardig adenoom tot kwaadaardig carcinoom is eerder in kaart gebracht voor de ontwikkeling van colorectale kanker en is van immens belang geweest voor ons huidige begrip van de ontwikkeling van kanker (Fearon en Vogelstein, 1990). In het geval van hemangioblastomen zal verdere kennis over gemeenschappelijke genetische gebeurtenissen in andere genen dan het VHL-gen die optreden in de vroege stadia van hemangioblastoomprogressie helpen bepalen welke specifieke genen de groei en/of cyste-ontwikkeling kunnen stimuleren.

Eén groep identificeerde onlangs het verlies van HNF1B op chromosoom 17q als een potentiële moleculaire aanjager van hemangioblastoomtumorigenese met behulp van analyse van kopie-aantalvariatie in tumor-DNA (Sun M et al., 2014). Andere groepen hebben bewijs gevonden dat het verlies van ZAC1 op chromosoom 6q een belangrijke rol speelt bij zowel vHL-geassocieerde als sporadische hemangioblastoomtumorvorming in het CZS (Lemeta et al., 2007;Zhou et al., 2010). Meer systematische benaderingen die de genetische veranderingen van hemangioblastomen in een breder perspectief onderzoeken, zouden echter onze kennis van de opeenvolging van genetische gebeurtenissen die leiden van tumorvoorlopers in een vroeg stadium tot volgroeide tumoren aanzienlijk kunnen vergroten. Deze kennis is van enorm belang, zowel met betrekking tot ons algemene begrip van het ontstaan ​​van tumoren, maar ook met betrekking tot de detectie van vroege noodzakelijke genetische gebeurtenissen die optreden in alle hemangioblastomen in vroege stadia van tumorontwikkeling en die mogelijk het proces aansturen. Dergelijke noodzakelijke gebeurtenissen in de tumorprecursorcellen kunnen worden gebruikt als biomarkers in weefselbiopten of tumorcellen die in de bloedbaan terechtkomen om te bepalen welke patiënten het meeste risico lopen op agressieve tumorgroei. Ten slotte zouden veranderingen in specifieke genen waarvan bekend is dat ze sleutelstappen zijn bij het omzetten van een tumorprecursor in klinisch significante tumoren, voor de hand liggende kandidaten zijn om zich op te richten bij de ontwikkeling van antitumorgeneesmiddelen.

Onlangs zijn next generation sequencing (NGS) technieken met succes gebruikt om genetische profielen en sequentie van specifieke genetische gebeurtenissen te bepalen in relatie tot individuele tumorprogressie in meerdere andere tumortypes, waaronder zowel sporadisch als vHL-geassocieerd niercelcarcinoom (RCC) (Fisher et al., 2014; Gossage et al., 2015; Gundem et al., 2015; Kroigard et al., 2015). NGS maakt het mogelijk om somatische variaties in het gehele genoom van een tumor (d.w.z. variaties die zich specifiek in het DNA van de tumor hebben ontwikkeld en niet in het kiembaan-DNA van de patiënt) (Nik-Zainal, 2014).

De onderzoekers van het onderzoek veronderstellen dat verschillende CZS-hemangioblastomen genetische veranderingen delen in specifieke genen die tumorontwikkeling vanuit VHL-deficiënte cellen bevorderen of initiëren, d.w.z. genetische drijfveren van tumorontwikkeling. De onderzoekers veronderstellen verder dat sommige van deze genetische veranderingen stappen vertegenwoordigen in de opeenvolging van hemangioblastoomprogressie. Door genetische veranderingen in tumoren in verschillende stadia van ontwikkeling, met verschillende groeipatronen en met en zonder geassocieerde cysteontwikkeling te vergelijken, kan de onderzoeker de mogelijke ontwikkelingsgerelateerde genetische veranderingen die in deze sequentie voorkomen ophelderen. Op basis van hoe vaak genetische varianten worden gedeeld door de afzonderlijke tumoren, kan worden geschat welke genen waarschijnlijk betrokken zijn in verschillende stadia van de ontwikkeling van hemangioblastoom. In dit pilootproject zijn de onderzoekers van plan om zowel afzonderlijke tumoren afkomstig van dezelfde patiënt als tumoren afkomstig van verschillende patiënten te analyseren om intra- en interpatiëntverschillen te evalueren.

Bevindingen van kandidaat-genetische factoren in dit project zullen vervolgens worden bevestigd in een grotere reeks van zowel vHL-geassocieerde als sporadische CZS-hemangioblastomen, die in een continu proces zullen worden verzameld. Ook zijn de onderzoekers van plan om de bevindingen te vergelijken met recente bevindingen van kandidaat-genetische factoren in niercelcarcinomen in een lopend project dat wordt uitgevoerd door enkele van onze medewerkers.

Materiaal De onderzoekers hebben Deense vHL-patiënten geïdentificeerd via meerdere nationale gezondheidsregisters en patiënten ouder dan 18 jaar gevraagd om deel te nemen. Instemmende deelnemers werden geïnterviewd over hun medische geschiedenis en de informatie werd geverifieerd door middel van medische dossiers.

De VHL-kiemlijnmutaties van de deelnemers worden geïdentificeerd met behulp van DNA dat is geëxtraheerd uit perifere bloedmonsters, en voor dit proefproject zullen alleen die met een identificeerbare pathogene VHL-kiemlijnmutatie gevonden in DNA van perifere lymfocyten met behulp van directe sequencing van exons en exon-introngrenzen en MLPA, worden opgenomen.

In het onderzoek worden weefselmonsters verzameld van alle verkrijgbare CZS-hemangioblastomen die chirurgisch zijn verwijderd als onderdeel van de behandeling van een deelnemer, ofwel als in paraffine ingebed weefsel, als vers ingevroren weefsel of als vers weefsel dat is geconserveerd in RNAlater.

Voor het voorgestelde project zullen ten minste twee haalbare CZS-hemangioblastomen van elke deelnemer worden geselecteerd voor NGS-analyse. De onderzoekers verwachten DNA van ten minste 19 tumormonsters te kunnen opnemen, waaronder DNA dat is geëxtraheerd uit zowel in paraffine ingebed tumorweefsel, vers ingevroren als weefsel gesuspendeerd in RNAlater.

Methoden DNA van elke deelnemer wordt geïsoleerd uit tumorweefsel en uit normaal weefsel (d.w.z. perifeer bloed) met behulp van standaardprotocollen. Het in paraffine ingebedde weefsel kan zowel tumorweefsel als normaal omringend weefsel bevatten. Om er zeker van te zijn dat het DNA van het weefsel het tumor-DNA vertegenwoordigt, zullen de onderzoekers eerst HE-gekleurde secties evalueren en ervoor zorgen dat > 85% van de weefselsectie tumor bevat.

Exome-verrijking van zowel tumor- als normaal weefsel-DNA zal worden uitgevoerd met behulp van een Niblegen 64Mb-panel met alle bekende genen, evenals miRNA- en lincRNA-genen. Het verrijkte DNA zal worden gesequenced met behulp van het Illumina Hiseq1500-platform met gepaarde eindsequencing van 2X100 basen en een gemiddelde dekkingsgraad van 75-100 x. De resultaten van elk tumor-DNA-monster zullen worden vergeleken met het DNA van het normale weefsel van de patiënt om kiembaanvariaties te onderscheiden van tumorspecifieke genetische veranderingen en zo het profiel te verkrijgen van somatische genetische veranderingen die behoren tot het tumor-DNA.

Somatische mutaties zullen worden geïdentificeerd met behulp van software voor het oproepen van somatische varianten, zoals VarScan, Mutect, EBCall of Virmid. Geïdentificeerde somatische varianten die zich bij het exoom van de tumor bevinden, zullen worden beoordeeld, en somatische kopieergebeurtenissen zullen worden geïdentificeerd door middel van kopieernummerprofilering van de NGS-gegevens met behulp van ngCGH-, Contra- en Nexus-software. Geïdentificeerde somatische puntmutaties zullen worden gevalideerd met behulp van gerichte deep sequencing. De onderzoekers zullen chromosomale kandidaat-regio's selecteren op basis van terugkerende varianten in tumoren.

De klinische kenmerken van elke tumor voorafgaand aan chirurgische verwijdering zullen worden beoordeeld door middel van evaluatie van seriële radiologische gegevens (MRI's van het CZS) van de jarenlange jaarlijkse surveillance van elke deelnemer en aanvullende diagnostische onderzoeken:

1. Tumorgrootte: bepaald door tumorvolume (breedte x lengte x hoogte) x 0,5 (mm3)
2. Tumorontwikkelingstijd: beoordeeld aan de hand van het tijdsinterval vanaf de tumor die voor het eerst zichtbaar was op MRI tot het tijdstip van de operatie
3. Tumorgroeisnelheid: beoordeeld aan de hand van radiologische progressie, d.w.z. verandering in tumorvolume/tijdsinterval tussen twee MRI's (maanden)
4. Tumorgroeifase: beoordeeld aan de hand van welke groeifase de tumor was voorafgaand aan de operatie (stagnatie vs. groeifase gedefinieerd door verandering in tumorvolume in de tijdsintervallen tussen de laatste drie MRI's)
5. Bijbehorende cysteontwikkeling en cystegrootte voorafgaand aan de operatie: beoordeeld aan de hand van het cystevolume bij de laatste MRI voorafgaand aan de operatie.

Deze klinische informatie zal worden vergeleken met het genetische profiel van de tumor om eventuele klinische associaties met mogelijke moleculaire factoren te beoordelen.