Driver dell'angiogenesi indotta da ipossia nello sviluppo del tumore

Sfondo Lo sviluppo delle cellule tumorali richiede una serie di capacità acquisite per crescere e diffondersi: 1) autosufficienza nei segnali di crescita, 2) insensibilità ai segnali di inibizione della crescita, 3) elusione dell'apoptosi (morte cellulare programmata), 4) potenziale replicativo illimitato, 5 ) angiogenesi sostenuta e 6) invasione tissutale e metastasi (Hanahan e Weinberg, 2000). L'acquisizione di queste capacità è guidata da mutazioni in oncogeni chiave e geni oncosoppressori, sebbene i meccanismi esatti non siano ancora del tutto chiari. Soprattutto l'angiogenesi è cruciale per la sopravvivenza di una cellula poiché la sua continua moltiplicazione dipende dall'ossigeno e dai nutrienti forniti nel sistema vascolare (Hanahan e Weinberg, 2000). L'angiogenesi può essere avviata dalla mancanza di ossigeno (ipossia) e il percorso di rilevamento dell'ossigeno della cellula media una risposta. In condizioni normali e in presenza di ossigeno, la proteina VHL, pVHL media il legame di un complesso di ubiquitina ligasi a un gruppo di fattori di trascrizione chiamati Fattori inducibili di ipossia (HIF) e dirige le subunità HIF-α alla degradazione proteosomica. Pertanto, nelle cellule normali con sufficiente ossigeno, la trascrizione indotta da HIF-α dei geni bersaglio è inibita. Durante l'ipossia, l'HIF-α non è idrossilato e quindi non è riconosciuto dalla proteina VHL. Gli HIF si traslocano nel nucleo e inducono la trascrizione di numerosi geni, molti dei quali codificano fattori angiogenici che stimolano la crescita di nuovi vasi (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). La crescita del cancro richiede grandi quantità di ossigeno e la maggior parte delle cellule tumorali è in un costante stato di ipossia.

Se non c'è pVHL funzionale in una cellula, reagisce come se avesse bisogno di ossigeno, poiché gli HIF stimoleranno l'angiogenesi indipendentemente dai livelli di ossigeno. Pertanto i pazienti con mutazioni germinali nel gene VHL possono fungere da modello di angiogenesi indotta dall'ipossia. I pazienti con mutazioni VHL della linea germinale hanno la malattia di von Hippel-Lindaus (vHL) e sono inclini allo sviluppo di tumori a causa di questo meccanismo, principalmente carcinoma a cellule renali e emangioblastomi del sistema nervoso centrale (SNC) (Maher et al., 2011). Anche se gli emangioblastomi sono tumori istologicamente benigni, possono avere gravi conseguenze. Lo sviluppo naturale degli emangioblastomi è caratterizzato da periodi imprevedibili di crescita e stagnazione. Spesso sviluppano cisti associate che colpiscono il tessuto nervoso adiacente e causano sintomi massicci, poiché anche piccoli cambiamenti di volume nel cervello possono causare gravi danni neurologici o addirittura la morte (Ammerman et al., 2006; Glasker et al., 2010; Wanebo et al. , 2003).

I meccanismi alla base della tumorigenesi associata a vHL sono complessi e non ancora del tutto compresi. Un evento chiave è la perdita di un prodotto proteico VHL funzionale come risultato dell'inattivazione di entrambi gli alleli del gene VHL secondo l'ipotesi dei due colpi di Knudson (Vortmeyer et al., 2013). Tuttavia, è anche chiaro che sebbene l'inattivazione di entrambe le copie del gene VHL di una persona sia necessaria, non sembra essere sufficiente per lo sviluppo dell'emangioblastoma (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004). L'inattivazione del VHL biallelico può essere presente sotto forma di più precursori tumorali in tutti i tessuti predisposti e la maggior parte non si sviluppa mai in tumori che causano sintomi reali (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004).

La domanda chiave per una migliore comprensione di come rallentare o arrestare lo sviluppo del tumore è l'identificazione di quali specifici fattori aggiuntivi avviano o promuovono lo sviluppo e la crescita del tumore. Lo sviluppo del tumore può iniziare in una singola cellula che sfugge al normale controllo della divisione cellulare, ma quando la cellula si divide e si moltiplica, le cellule figlie passano attraverso una sequenza di molteplici eventi genetici in molti geni diversi che si accumulano e forniscono al tumore vantaggi di crescita ( Hanahan e Weinberg, 2011). Tale sequenza dall'adenoma benigno al carcinoma maligno è stata precedentemente mappata per lo sviluppo del cancro del colon-retto ed è stata di immensa importanza per la nostra attuale comprensione dello sviluppo del cancro (Fearon e Vogelstein, 1990). Nel caso degli emangioblastomi, un'ulteriore conoscenza di eventuali eventi genetici comuni in geni diversi dal gene VHL che si verificano nelle prime fasi della progressione dell'emangioblastoma aiuterà a determinare quali geni specifici possono essere guidati, ovvero promuovere la crescita e/o lo sviluppo della cisti.

Un gruppo ha recentemente identificato la perdita di HNF1B sul cromosoma 17q come potenziale motore molecolare della tumorigenesi dell'emangioblastoma utilizzando l'analisi della variazione del numero di copie nel DNA tumorale (Sun M et al., 2014). Altri gruppi hanno trovato prove che la perdita di ZAC1 sul cromosoma 6q svolge un ruolo importante nella tumorigenesi dell'emangioblastoma del SNC sia associata a vHL che sporadica (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). Tuttavia, approcci più sistematici che indagano le alterazioni genetiche degli emangioblastomi in una prospettiva più ampia potrebbero aumentare notevolmente la nostra conoscenza della sequenza di eventi genetici che portano dai precursori tumorali in fase iniziale a tumori completamente cresciuti. Questa conoscenza è di grande importanza, sia in relazione alla nostra comprensione generale della tumorigenesi, ma anche in relazione al rilevamento di eventi genetici precoci necessari che si verificano in tutti gli emangioblastomi nelle prime fasi dello sviluppo del tumore e che potrebbero guidare il processo. Tali eventi necessari nelle cellule precursori del tumore possono essere utilizzati come biomarcatori nelle biopsie tissutali o nelle cellule tumorali che entrano nel flusso sanguigno per determinare quali pazienti sono maggiormente a rischio di crescita tumorale aggressiva. Infine, i cambiamenti in geni specifici che sono noti per essere passaggi chiave nel trasformare un precursore del tumore in tumori clinicamente significativi sarebbero ovvi candidati da prendere di mira nello sviluppo di farmaci antitumorali.

Recentemente, le tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono state utilizzate con successo per determinare i profili genetici e la sequenza di eventi genetici specifici in relazione alla progressione del tumore individuale in molti altri tipi di tumore, inclusi carcinoma a cellule renali (RCC) sia sporadici che associati a vHL (Fisher et al., 2014; Gossage et al., 2015; Gundem et al., 2015; Kroigard et al., 2015). NGS consente di esaminare le variazioni somatiche nell'intero genoma di un tumore (es. variazioni che si sono sviluppate specificamente nel DNA del tumore e non nel DNA germinale del paziente) (Nik-Zainal, 2014).

I ricercatori dello studio ipotizzano che diversi emangioblastomi del sistema nervoso centrale condividano alterazioni genetiche in geni specifici che promuovono o avviano lo sviluppo del tumore da cellule con deficienza di VHL, ovvero driver genetici dello sviluppo del tumore. I ricercatori ipotizzano inoltre che alcune di queste alterazioni genetiche rappresentino passaggi nella sequenza della progressione dell'emangioblastoma. Confrontando le alterazioni genetiche nei tumori a diversi stadi di sviluppo, con diversi modelli di crescita e con e senza sviluppo di cisti associato, il ricercatore cerca di chiarire le possibili alterazioni genetiche correlate allo sviluppo che si verificano in questa sequenza. Sulla base della frequenza con cui le varianti genetiche sono condivise dai singoli tumori, si può stimare quali geni sono probabilmente coinvolti nelle diverse fasi dello sviluppo dell'emangioblastoma. In questo progetto pilota, i ricercatori hanno in programma di analizzare tumori separati originati dallo stesso paziente e tumori originati da pazienti diversi per valutare le differenze intra e interpazienti.

I risultati dei driver genetici candidati in questo progetto saranno successivamente confermati in una serie più ampia di emangioblastomi del SNC sia associati a vHL che sporadici, che saranno raccolti in un processo in corso. Inoltre, i ricercatori hanno in programma di confrontare i risultati con le recenti scoperte di driver genetici candidati nei carcinomi a cellule renali in un progetto in corso condotto da alcuni dei nostri collaboratori.

Materiale Gli investigatori hanno identificato i pazienti danesi vHL attraverso più registri sanitari nazionali e hanno chiesto ai pazienti di età superiore ai 18 anni di partecipare. I partecipanti consenzienti sono stati intervistati sulle loro storie mediche e sulle informazioni verificate attraverso le cartelle cliniche.

Le mutazioni della linea germinale VHL dei partecipanti sono identificate utilizzando il DNA estratto da campioni di sangue periferico, e per questo progetto pilota solo quelli con una mutazione germinale VHL patogena identificabile trovata nel DNA dei linfociti periferici utilizzando il sequenziamento diretto di esoni e confini esone-introne e MLPA, lo faranno essere incluso.

Nello studio verranno raccolti campioni di tessuto da tutti gli emangioblastomi del SNC ottenibili che sono stati rimossi chirurgicamente come parte del trattamento di un partecipante, sia come tessuto incluso in paraffina, come tessuto fresco congelato o come tessuto fresco conservato successivamente in RNA.

Per il progetto proposto verranno selezionati almeno due emangioblastomi del SNC ottenibili da ciascun partecipante all'analisi NGS. Gli investigatori si aspettano di poter includere il DNA di almeno 19 campioni di tumore, incluso il DNA estratto da entrambi i tessuti tumorali inclusi in paraffina, freschi congelati e tessuti sospesi in RNA successivamente.

Metodi Il DNA di ciascun partecipante viene isolato dal tessuto tumorale e dal tessuto normale (es. sangue periferico) utilizzando protocolli standard. Il tessuto incluso in paraffina può contenere sia tessuto tumorale che normale tessuto circostante. Per garantire che il DNA del tessuto rappresenti il ​​DNA del tumore, gli investigatori valuteranno prima le sezioni colorate con HE e si assicureranno che > 85% della sezione del tessuto contenga tumore.

L'arricchimento dell'esoma sia del tumore che del DNA del tessuto normale sarà eseguito utilizzando un pannello Niblegen 64Mb che include tutti i geni noti così come i geni miRNA e lincRNA. Il DNA arricchito sarà sequenziato utilizzando la piattaforma Illumina Hiseq1500 con pairing end sequencing di 2X100 basi e un tasso di copertura medio di 75-100 x. I risultati di ciascun campione di DNA tumorale saranno confrontati con il DNA del tessuto normale del paziente per distinguere le variazioni germinali dalle alterazioni genetiche tumore-specifiche e quindi ottenere il profilo delle alterazioni genetiche somatiche appartenenti al DNA tumorale.

Le mutazioni somatiche saranno identificate utilizzando software di identificazione delle varianti somatiche come VarScan, Mutect, EBCall o Virmid. Verranno valutate le varianti somatiche identificate localizzate nell'esoma del tumore e gli eventi del numero di copie somatiche saranno identificati attraverso la profilazione del numero di copie dei dati NGS utilizzando il software ngCGH, Contra e Nexus. Le mutazioni puntiformi somatiche identificate saranno convalidate utilizzando un sequenziamento profondo mirato. Gli investigatori selezioneranno regioni candidate cromosomiche basate su varianti ricorrenti tra i tumori.

Le caratteristiche cliniche di ciascun tumore prima della rimozione chirurgica saranno valutate attraverso la valutazione dei dati radiologici seriali (MRI del sistema nervoso centrale) dalla sorveglianza annuale di ciascun partecipante e da ulteriori esami diagnostici:

1. Dimensioni del tumore: valutate in base al volume del tumore (larghezza x lunghezza x altezza) x 0,5 (mm3)
2. Tempo di sviluppo del tumore: valutato in base all'intervallo di tempo dal momento in cui il tumore è stato visibile per la prima volta alla risonanza magnetica al momento dell'intervento chirurgico
3. Tasso di crescita del tumore: valutato in base alla progressione radiologica, ovvero variazione del volume del tumore/intervallo di tempo tra due risonanze magnetiche (mesi)
4. Fase di crescita del tumore: valutata in base a quale fase di crescita si trovava il tumore prima dell'intervento chirurgico (fase stagnante rispetto a fase di crescita definita dalla variazione del volume del tumore negli intervalli di tempo tra le ultime tre risonanze magnetiche)
5. Sviluppo della cisti associato e dimensione della cisti prima dell'intervento chirurgico: valutato dal volume della cisti all'ultima risonanza magnetica prima dell'intervento.

Queste informazioni cliniche saranno confrontate con il profilo genetico del tumore per valutare eventuali associazioni cliniche a possibili driver molecolari.