Treiber der Hypoxie-induzierten Angiogenese in der Tumorentwicklung

Hintergrund Die Entwicklung von Krebszellen erfordert eine Reihe von erworbenen Fähigkeiten, um zu wachsen und sich auszubreiten: 1) Selbstversorgung mit Wachstumssignalen, 2) Unempfindlichkeit gegenüber Wachstumshemmungssignalen, 3) Umgehung der Apoptose (programmierter Zelltod), 4) grenzenloses Replikationspotential, 5 ) anhaltende Angiogenese und 6) Gewebeinvasion und Metastasierung (Hanahan und Weinberg, 2000). Der Erwerb dieser Fähigkeiten wird durch Mutationen in wichtigen Onkogenen und Tumorsuppressorgenen vorangetrieben, obwohl die genauen Mechanismen noch nicht vollständig verstanden sind. Besonders die Angiogenese ist entscheidend für das Überleben einer Zelle, da ihre fortgesetzte Vermehrung von der Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen im Gefäßsystem abhängt (Hanahan und Weinberg, 2000). Angiogenese kann durch Sauerstoffmangel (Hypoxie) initiiert werden, und der Sauerstofferfassungsweg der Zelle vermittelt eine Reaktion. Unter normalen Bedingungen und in Gegenwart von Sauerstoff vermittelt das VHL-Protein pVHL die Bindung eines Ubiquitin-Ligase-Komplexes an eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die als Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) bezeichnet werden, und lenkt die HIF-α-Untereinheiten zum proteosomalen Abbau. Somit wird in normalen Zellen mit genügend Sauerstoff die HIF-α-induzierte Transkription von Zielgenen gehemmt. Während einer Hypoxie wird das HIF-α nicht hydroxyliert und wird daher nicht vom VHL-Protein erkannt. Die HIFs wandern in den Zellkern und induzieren die Transkription zahlreicher Gene, von denen viele für angiogene Faktoren codieren, die das Wachstum neuer Gefäße stimulieren (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). Das Krebswachstum erfordert große Mengen an Sauerstoff und die meisten Tumorzellen befinden sich in einem konstanten Zustand der Hypoxie.

Wenn in einer Zelle kein funktionsfähiges pVHL vorhanden ist, reagiert sie so, als ob sie Sauerstoff benötigt, da HIFs unabhängig vom Sauerstoffgehalt die Angiogenese stimulieren. Daher können Patienten mit Keimbahnmutationen im VHL-Gen als Modell für Hypoxie-induzierte Angiogenese dienen. Patienten mit Keimbahn-VHL-Mutationen leiden an der von Hippel-Lindaus-Krankheit (vHL) und sind aufgrund dieses Mechanismus anfällig für Tumorentwicklung, hauptsächlich Nierenzellkarzinom und Hämangioblastome des zentralen Nervensystems (ZNS) (Maher et al., 2011). Obwohl Hämangioblastome histologisch gutartige Tumore sind, können sie schwerwiegende Folgen haben. Die natürliche Entwicklung von Hämangioblastomen ist durch unvorhersehbare Phasen des Wachstums und der Stagnation gekennzeichnet. Oft entwickeln sie assoziierte Zysten, die benachbartes Nervengewebe betreffen und massive Symptome verursachen, da bereits kleine Volumenänderungen im Gehirn schwere neurologische Schäden oder sogar den Tod verursachen können (Ammerman et al., 2006; Glasker et al., 2010; Wanebo et al. , 2003).

Die Mechanismen hinter der vHL-assoziierten Tumorentstehung sind komplex und noch nicht vollständig verstanden. Ein Schlüsselereignis ist der Verlust eines funktionellen VHL-Proteinprodukts infolge der Inaktivierung beider Allele des VHL-Gens gemäß Knudsons Two-Hit-Hypothese (Vortmeyer et al., 2013). Es ist jedoch auch klar, dass, obwohl die Inaktivierung beider Kopien des VHL-Gens einer Person notwendig ist, dies für die Entwicklung eines Hämangioblastoms nicht ausreichend zu sein scheint (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004). Biallelische VHL-Inaktivierung kann in Form mehrerer Tumorvorstufen in prädisponierten Geweben vorhanden sein und sich meist nie zu tatsächlichen symptomverursachenden Tumoren entwickeln (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004).

Die Schlüsselfrage für ein besseres Verständnis, wie die Tumorentwicklung verlangsamt oder gestoppt werden kann, ist die Identifizierung, welche spezifischen zusätzlichen Faktoren die Tumorentwicklung und das Tumorwachstum auslösen oder fördern. Die Tumorentwicklung kann in einer einzelnen Zelle initiiert werden, die sich der normalen Kontrolle der Zellteilung entzieht, aber wenn sich die Zelle teilt und vermehrt, durchlaufen die Tochterzellen eine Abfolge mehrerer genetischer Ereignisse in vielen verschiedenen Genen, die sich ansammeln und dem Tumor Wachstumsvorteile verschaffen ( Hanahan und Weinberg, 2011). Eine solche Abfolge von gutartigem Adenom zu bösartigem Karzinom wurde zuvor für die Entwicklung von kolorektalem Krebs kartiert und war für unser gegenwärtiges Verständnis der Krebsentwicklung von immenser Bedeutung (Fearon und Vogelstein, 1990). Im Fall von Hämangioblastomen wird weiteres Wissen über gemeinsame genetische Ereignisse in anderen Genen als dem VHL-Gen, die in den frühen Stadien der Hämangioblastomprogression auftreten, dazu beitragen, festzustellen, welche spezifischen Gene treibend sein können, d. h. das Wachstum und/oder die Zystenentwicklung fördern.

Eine Gruppe identifizierte kürzlich den Verlust von HNF1B auf Chromosom 17q als potenziellen molekularen Treiber der Hämangioblastom-Tumorentstehung, indem sie die Variation der Kopienzahl in der Tumor-DNA analysierte (Sun M et al., 2014). Andere Gruppen haben Hinweise darauf gefunden, dass der Verlust von ZAC1 auf Chromosom 6q sowohl bei der vHL-assoziierten als auch bei der sporadischen ZNS-Hämangioblastom-Tumorentstehung eine wichtige Rolle spielt (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). Systematischere Ansätze, die die genetischen Veränderungen von Hämangioblastomen in einer breiteren Perspektive untersuchen, könnten jedoch unser Wissen über die Abfolge genetischer Ereignisse, die von Tumorvorläufern im Frühstadium zu ausgewachsenen Tumoren führen, deutlich erweitern. Dieses Wissen ist von großer Bedeutung, sowohl in Bezug auf unser allgemeines Verständnis der Tumorentstehung, als auch in Bezug auf die Erkennung früher notwendiger genetischer Ereignisse, die bei allen Hämangioblastomen in frühen Stadien der Tumorentwicklung auftreten und den Prozess vorantreiben können. Solche notwendigen Ereignisse in den Tumorvorläuferzellen können als Biomarker in Gewebebiopsien oder Tumorzellen, die in die Blutbahn gelangen, verwendet werden, um festzustellen, bei welchen Patienten das Risiko eines aggressiven Tumorwachstums am größten ist. Schließlich wären Veränderungen in spezifischen Genen, von denen bekannt ist, dass sie Schlüsselschritte bei der Umwandlung von Tumorvorläufern in klinisch signifikante Tumore sind, offensichtliche Kandidaten für die Entwicklung von Antitumor-Medikamenten.

Kürzlich wurden Next Generation Sequencing (NGS)-Techniken erfolgreich eingesetzt, um genetische Profile und Sequenzen spezifischer genetischer Ereignisse in Bezug auf die individuelle Tumorprogression bei mehreren anderen Tumorarten zu bestimmen, einschließlich sowohl sporadischer als auch vHL-assoziierter Nierenzellkarzinome (RCC) (Fisher et al., 2014; Gossage et al., 2015; Gundem et al., 2015; Kroigard et al., 2015). NGS ermöglicht die Untersuchung somatischer Variationen im gesamten Genom eines Tumors (d. h. Variationen, die sich speziell in der DNA des Tumors und nicht in der Keimbahn-DNA des Patienten entwickelt haben) (Nik-Zainal, 2014).

Die Forscher der Studie gehen davon aus, dass verschiedene ZNS-Hämangioblastome genetische Veränderungen in spezifischen Genen gemeinsam haben, die die Tumorentwicklung aus VHL-defizienten Zellen fördern oder initiieren, d. h. genetische Treiber der Tumorentwicklung. Die Forscher gehen weiter davon aus, dass einige dieser genetischen Veränderungen Schritte in der Abfolge der Hämangioblastom-Progression darstellen. Durch den Vergleich genetischer Veränderungen bei Tumoren in unterschiedlichen Entwicklungsstadien, mit unterschiedlichen Wachstumsmustern und mit und ohne assoziierter Zystenentwicklung wollen die Untersucher die möglichen entwicklungsbedingten genetischen Veränderungen aufklären, die in dieser Abfolge auftreten. Basierend darauf, wie oft genetische Varianten von den einzelnen Tumoren geteilt werden, kann abgeschätzt werden, welche Gene wahrscheinlich in verschiedenen Stadien der Hämangioblastomentwicklung beteiligt sind. In diesem Pilotprojekt planen die Forscher, separate Tumore zu analysieren, die von demselben Patienten stammen, sowie Tumore, die von verschiedenen Patienten stammen, um Unterschiede innerhalb und zwischen den Patienten zu bewerten.

Die Erkenntnisse über potenzielle genetische Treiber in diesem Projekt werden anschließend in einer größeren Serie von sowohl vHL-assoziierten als auch sporadischen ZNS-Hämangioblastomen bestätigt, die in einem laufenden Prozess gesammelt werden. Außerdem planen die Forscher, die Ergebnisse in einem laufenden Projekt, das von einigen unserer Mitarbeiter durchgeführt wird, mit den jüngsten Ergebnissen von potenziellen genetischen Treibern bei Nierenzellkarzinomen zu vergleichen.

Material Die Forscher haben dänische vHL-Patienten durch mehrere nationale Gesundheitsregister identifiziert und Patienten über 18 Jahren zur Teilnahme aufgefordert. Die zustimmenden Teilnehmer wurden zu ihrer Krankengeschichte befragt und die Informationen anhand von Krankenakten überprüft.

Die VHL-Keimbahnmutationen der Teilnehmer werden anhand von DNA identifiziert, die aus peripheren Blutproben extrahiert wurde, und für dieses Pilotprojekt werden nur diejenigen mit einer identifizierbaren pathogenen VHL-Keimbahnmutation, die in DNA von peripheren Lymphozyten unter Verwendung einer direkten Sequenzierung von Exons und Exon-Intron-Grenzen und MLPA gefunden wurde, identifiziert enthalten sein.

In der Studie werden Gewebeproben von allen erhältlichen ZNS-Hämangioblastomen entnommen, die im Rahmen der Behandlung eines Teilnehmers chirurgisch entfernt wurden, entweder als in Paraffin eingebettetes Gewebe, als frisch gefrorenes Gewebe oder als in RNAlater konserviertes frisches Gewebe.

Für das vorgeschlagene Projekt werden mindestens zwei erreichbare ZNS-Hämangioblastome von jedem Teilnehmer NGS-Analyse ausgewählt. Die Forscher gehen davon aus, DNA von mindestens 19 Tumorproben einbeziehen zu können, einschließlich DNA, die sowohl aus in Paraffin eingebettetem Tumorgewebe als auch aus frisch gefrorenem und in RNAlater suspendiertem Gewebe extrahiert wurde.

Methoden DNA von jedem Teilnehmer wird aus Tumorgewebe und aus normalem Gewebe (d. h. peripheres Blut) unter Verwendung von Standardprotokollen. Das in Paraffin eingebettete Gewebe kann sowohl Tumorgewebe als auch normales umgebendes Gewebe enthalten. Um sicherzustellen, dass die DNA aus dem Gewebe die Tumor-DNA darstellt, werten die Forscher zunächst HE-gefärbte Schnitte aus und stellen sicher, dass > 85 % des Gewebeschnitts Tumor enthalten.

Die Exom-Anreicherung von Tumor- und Normalgewebe-DNA wird unter Verwendung eines Niblegen 64 MB-Panels durchgeführt, das alle bekannten Gene sowie miRNA- und lincRNA-Gene enthält. Die angereicherte DNA wird mithilfe der Illumina Hiseq1500-Plattform mit Paired-End-Sequenzierung von 2 x 100 Basen und einer mittleren Abdeckungsrate von 75-100 x sequenziert. Die Ergebnisse jeder Tumor-DNA-Probe werden mit der DNA des normalen Gewebes des Patienten verglichen, um Keimbahnvariationen von tumorspezifischen genetischen Veränderungen zu unterscheiden und dadurch das Profil der somatischen genetischen Veränderungen zu erhalten, die zur Tumor-DNA gehören.

Somatische Mutationen werden mithilfe von Caller-Software für somatische Varianten wie VarScan, Mutect, EBCall oder Virmid identifiziert. Identifizierte somatische Varianten, die sich im Exom des Tumors befinden, werden bewertet, und somatische Kopienzahlereignisse werden durch Kopienzahlprofilierung der NGS-Daten unter Verwendung von ngCGH-, Contra- und Nexus-Software identifiziert. Identifizierte somatische Punktmutationen werden mittels gezielter Tiefensequenzierung validiert. Die Ermittler werden chromosomale Kandidatenregionen basierend auf rezidivierenden Varianten bei allen Tumoren auswählen.

Die klinischen Merkmale jedes Tumors vor der chirurgischen Entfernung werden durch Auswertung serieller radiologischer Daten (MRTs des ZNS) aus der einjährigen jährlichen Überwachung jedes Teilnehmers und zusätzlichen diagnostischen Untersuchungen bewertet:

1. Tumorgröße: Bewertet anhand des Tumorvolumens (Breite x Länge x Höhe) x 0,5 (mm3)
2. Tumorentwicklungszeit: Bewertet anhand des Zeitintervalls von der erstmaligen Sichtbarkeit des Tumors im MRT bis zum Zeitpunkt der Operation
3. Tumorwachstumsrate: Beurteilt durch radiologischen Verlauf, d. h. Änderung des Tumorvolumens/Zeitintervall zwischen zwei MRTs (Monate)
4. Tumorwachstumsphase: Beurteilt, in welcher Wachstumsphase sich der Tumor vor der Operation befand (stagnierende vs. Wachstumsphase, definiert durch Veränderung des Tumorvolumens in den Zeitintervallen zwischen den letzten drei MRTs)
5. Assoziierte Zystenentwicklung und Zystengröße vor der Operation: Beurteilt durch das Zystenvolumen bei der letzten MRT vor der Operation.

Diese klinischen Informationen werden mit dem genetischen Profil des Tumors verglichen, um klinische Assoziationen mit möglichen molekularen Treibern zu beurteilen.