Drivkrafter för hypoxiinducerad angiogenes i tumörutveckling

Bakgrund Utveckling av cancerceller kräver en serie förvärvade förmågor för att växa och spridas: 1) självförsörjning med tillväxtsignaler, 2) okänslighet för tillväxthämningssignaler, 3) undvikande av apoptos (programmerad celldöd), 4) obegränsad replikativ potential, 5 ) ihållande angiogenes och 6) vävnadsinvasion och metastasering (Hanahan och Weinberg, 2000). Förvärvet av dessa förmågor drivs av mutationer i viktiga onkogener och tumörsuppressorgener, även om de exakta mekanismerna ännu inte är helt klarlagda. Särskilt angiogenes är avgörande för en cells överlevnad eftersom dess fortsatta förökning beror på syre och näringsämnen som tillförs i kärlsystemet (Hanahan och Weinberg, 2000). Angiogenes kan initieras av syrebrist (hypoxi), och cellens syreavkänningsväg förmedlar ett svar. Under normala förhållanden och i närvaro av syre, VHL-proteinet, förmedlar pVHL bindningen av ett ubiquitinligaskomplex till en grupp av transkriptionsfaktorer som kallas Hypoxia inducible Factors (HIFs) och styr HIF-α-subenheterna till proteosomal nedbrytning. I normala celler med tillräckligt med syre hämmas således HIF-a-inducerad transkription av målgener. Under hypoxi hydroxyleras inte HIF-a och känns därför inte igen av VHL-proteinet. HIF:erna translokeras till kärnan och inducerar transkription av många gener, många kodar för angiogena faktorer som stimulerar tillväxt av nya kärl (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). Cancertillväxt kräver stora mängder syre och de flesta tumörceller är i ett konstant tillstånd av hypoxi.

Om det inte finns någon funktionell pVHL i en cell reagerar den som om den behöver syre, eftersom HIF stimulerar angiogenes oavsett syrenivåer. Därför kan patienter med könslinjemutationer i VHL-genen fungera som en modell för hypoxiinducerad angiogenes. Patienter med könslinje-VHL-mutationer har von Hippel-Lindaus sjukdom (vHL) och är benägna att utveckla tumörer på grund av denna mekanism, främst njurcellscancer och hemangioblastom i centrala nervsystemet (Maher et al., 2011). Även om hemangioblastom är histologiskt godartade tumörer kan de få allvarliga konsekvenser. Den naturliga utvecklingen av hemangioblastom kännetecknas av oförutsägbara perioder av tillväxt och stagnation. Ofta utvecklar de associerade cystor som påverkar intilliggande nervvävnad och orsakar massiva symtom, eftersom även små volymförändringar i hjärnan kan orsaka allvarlig neurologisk skada eller till och med död (Ammerman et al., 2006;Glasker et al., 2010;Wanebo et al. 2003).

Mekanismerna bakom vHL-associerad tumörgenes är komplexa och ännu inte helt förstådda. En nyckelhändelse är förlust av en funktionell VHL-proteinprodukt som ett resultat av inaktivering av båda allelerna i VHL-genen i enlighet med Knudsons tvåträffshypotes (Vortmeyer et al., 2013). Men det är också tydligt att även om inaktivering av båda kopiorna av en persons VHL-gen är nödvändig, verkar det inte vara tillräckligt för utveckling av hemangioblastom (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004). Biallelisk VHL-inaktivering kan förekomma i form av flera tumörprekursorer i predisponerade vävnader, och de flesta utvecklas aldrig till faktiska symtomorsakande tumörer (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004).

Nyckelfrågan för en bättre förståelse av hur man bromsar eller stoppar tumörutveckling är identifiering av vilka specifika ytterligare faktorer som initierar eller främjar tumörutveckling och tillväxt. Tumörutveckling kan initieras i en enda cell som undviker normal kontroll av celldelning, men när cellen delar sig och förökar sig går dottercellerna igenom en sekvens av flera genetiska händelser i många olika gener som ackumuleras och ger tumören tillväxtfördelar ( Hanahan och Weinberg, 2011). En sådan sekvens från benignt adenom till malignt karcinom har tidigare kartlagts för utveckling av kolorektal cancer och har varit av enorm betydelse för vår nuvarande förståelse av cancerutveckling (Fearon och Vogelstein, 1990). När det gäller hemangioblastom kommer ytterligare kunskap om eventuella vanliga genetiska händelser i andra gener än VHL-genen som inträffar i de tidiga stadierna av hemangioblastomprogression att hjälpa till att avgöra vilka specifika gener som kan driva, det vill säga främja tillväxt och/eller cystorutveckling.

En grupp identifierade nyligen förlust av HNF1B på kromosom 17q för att vara en potentiell molekylär drivkraft för hemangioblastomtumörbildning med hjälp av analys av kopietalsvariation i tumör-DNA (Sun M et al., 2014). Andra grupper har hittat bevis för att förlust av ZAC1 på kromosom 6q spelar en stor roll vid både vHL-associerad och sporadisk CNS-hemangioblastomtumörbildning (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). Men mer systematiska tillvägagångssätt för att undersöka hemangioblastoms genetiska förändringar i ett bredare perspektiv kan markant öka vår kunskap om sekvensen av genetiska händelser som leder från tidiga tumörprekursorer till fullvuxna tumörer. Denna kunskap är av stor betydelse, både i relation till vår allmänna förståelse av tumörbildning, men också i relation till upptäckt av tidiga nödvändiga genetiska händelser som inträffar i alla hemangioblastom i tidiga skeden av tumörutvecklingen och som kan driva processen. Sådana nödvändiga händelser i tumörprekursorcellerna kan användas som biomarkörer i vävnadsbiopsier eller tumörceller som tar sig in i blodomloppet för att avgöra vilka patienter som löper störst risk för aggressiv tumörtillväxt. Slutligen, förändringar i specifika gener som är kända för att vara nyckelsteg för att förvandla en tumörprekursor till kliniskt signifikanta tumörer skulle vara uppenbara kandidater att rikta in sig på i utvecklingen av antitumörläkemedel.

Nyligen har nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) framgångsrikt använts för att bestämma genetiska profiler och sekvens av specifika genetiska händelser i relation till individuell tumörprogression i flera andra tumörtyper, inklusive både sporadiskt och vHL-associerat njurcellscancer (RCC) (Fisher) et al., 2014;Gossage et al., 2015;Gundem et al., 2015;Kroigard et al., 2015). NGS gör det möjligt att undersöka somatiska variationer i en tumörs hela genom (dvs. variationer som har utvecklats specifikt i tumörens DNA och inte i patientens könscells-DNA)(Nik-Zainal, 2014).

Studiens utredare hypotes att olika CNS-hemangioblastom delar genetiska förändringar i specifika gener som främjar eller initierar tumörutveckling från celler med VHL-brist, det vill säga genetiska drivkrafter för tumörutveckling. Utredarna antar vidare att några av dessa genetiska förändringar representerar steg i sekvensen av hemangioblastomprogression. Genom att jämföra genetiska förändringar i tumörer i olika utvecklingsstadier, med olika tillväxtmönster och med och utan associerad cystautveckling, försökte forskaren belysa de möjliga utvecklingsrelaterade genetiska förändringarna som uppstår i denna sekvens. Baserat på hur ofta genetiska varianter delas av de separata tumörerna, kan det uppskattas vilka gener som sannolikt är involverade i olika stadier i utvecklingen av hemangioblastom. I detta pilotprojekt planerar utredarna att analysera separata tumörer som kommer från samma patient samt tumörer som kommer från olika patienter för att utvärdera skillnader inom och mellan patienter.

Fynden av kandidater för genetiska drivkrafter i detta projekt kommer därefter att bekräftas i en större serie av både vHL-associerade såväl som sporadiska CNS-hemangioblastom, som kommer att samlas in i en pågående process. Utredarna planerar också att jämföra resultaten med nya fynd av kandidater för genetiska drivkrafter i njurcellscancer i ett pågående projekt som utförs av några av våra medarbetare.

Material Utredarna har identifierat danska vHL-patienter genom flera nationella hälsoregister och bett patienter över 18 år att delta. Samtyckande deltagare intervjuades om deras medicinska historia och informationen verifierades genom medicinska journaler.

Deltagarnas VHL könscellsmutationer identifieras med hjälp av DNA extraherat från perifera blodprover, och för detta pilotprojekt kommer endast de med en identifierbar patogen VHL könscellsmutation som hittas i DNA från perifera lymfocyter med hjälp av direkt sekvensering av exoner och exon-intron-gränser och MLPA, att inkluderas.

I studien kommer vävnadsprover från alla erhållbara CNS-hemangioblastom som har avlägsnats kirurgiskt som en del av en deltagares behandling att samlas in, antingen som paraffininbäddad vävnad, som färsk frusen vävnad eller som färsk vävnad konserverad i RNAlater.

För det föreslagna projektet kommer minst två uppnåbara CNS-hemangioblastom från varje deltagare att väljas NGS-analys. Utredarna förväntar sig att kunna inkludera DNA från minst 19 tumörprover, inklusive DNA extraherat från både paraffininbäddad tumörvävnad, färskfryst och vävnad suspenderad i RNAlater.

Metoder DNA från varje deltagare isoleras från tumörvävnad och från normal vävnad (dvs. perifert blod) med användning av standardprotokoll. Den paraffininbäddade vävnaden kan innehålla både tumörvävnad och normal omgivande vävnad. För att säkerställa att DNA från vävnaden representerar tumör-DNA:t kommer utredarna först att utvärdera HE-färgade sektioner och säkerställa att > 85 % av vävnadssektionen innehåller tumör.

Exomanrikning av både tumör- och normalvävnads-DNA kommer att utföras med hjälp av en Niblegen 64Mb-panel inklusive alla kända gener samt miRNA- och lincRNA-gener. Det anrikade DNA:t kommer att sekvenseras med hjälp av Illumina Hiseq1500-plattformen med parad ändsekvensering av 2X100 baser och en genomsnittlig täckningsgrad på 75-100 x. Resultaten från varje tumör-DNA-prov kommer att jämföras med DNA från patientens normala vävnad för att skilja könslinjevariationer från tumörspecifika genetiska förändringar och därigenom erhålla profilen av somatiska genetiska förändringar som hör till tumör-DNA.

Somatiska mutationer kommer att identifieras med hjälp av mjukvara för somatisk variant som VarScan, Mutect, EBCall eller Virmid. Identifierade somatiska varianter lokaliserade till tumörens exom kommer att bedömas, och somatiska kopienummerhändelser kommer att identifieras genom kopienummerprofilering av NGS-data med hjälp av ngCGH, Contra och Nexus programvara. Identifierade somatiska punktmutationer kommer att valideras med hjälp av riktad djupsekvensering. Utredarna kommer att välja kromosomala kandidatregioner baserat på återkommande varianter över tumörer.

Varje tumörs kliniska egenskaper före kirurgiskt avlägsnande kommer att bedömas genom utvärdering av seriella radiologiska data (MRI av CNS) från varje deltagares årslånga årliga övervakning och ytterligare diagnostiska undersökningar:

1. Tumörstorlek: Bedömd efter tumörvolym (bredd x längd x höjd) x 0,5 (mm3)
2. Tumörutvecklingstid: Bedömd efter tidsintervall från tumören var först synlig på MRT till tidpunkten för operationen
3. Tumörtillväxthastighet: Bedöms genom radiologisk progression, dvs förändring i tumörvolym/tidsintervall mellan två MRI (månader)
4. Tumörtillväxtfas: Bedöms utifrån vilken tillväxtfas tumören befann sig i före operationen (stagnant vs. tillväxtfas definierad av förändring i tumörvolym i tidsintervallen mellan de senaste tre MRI-undersökningarna)
5. Associerad cystautveckling och cystastorlek före operation: Bedömd genom cystavolym vid sista MRT före operation.

Denna kliniska information kommer att jämföras med tumörens genetiska profil för att bedöma eventuella kliniska associationer till möjliga molekylära drivkrafter.