Impulsores de la angiogénesis inducida por hipoxia en el desarrollo tumoral

Antecedentes El desarrollo de las células cancerosas requiere una serie de capacidades adquiridas para crecer y propagarse: 1) autosuficiencia en las señales de crecimiento, 2) insensibilidad a las señales de inhibición del crecimiento, 3) evasión de la apoptosis (muerte celular programada), 4) potencial replicativo ilimitado, 5 ) angiogénesis sostenida y 6) invasión tisular y metástasis (Hanahan y Weinberg, 2000). La adquisición de estas capacidades está impulsada por mutaciones en oncogenes clave y genes supresores de tumores, aunque los mecanismos exactos aún no se conocen por completo. Especialmente la angiogénesis es crucial para la supervivencia de una célula, ya que su multiplicación continua depende del oxígeno y los nutrientes suministrados en la vasculatura (Hanahan y Weinberg, 2000). La angiogénesis puede iniciarse por falta de oxígeno (hipoxia) y la vía de detección de oxígeno de la célula media una respuesta. En condiciones normales y en presencia de oxígeno, la proteína VHL pVHL media en la unión de un complejo de ubiquitina ligasa a un grupo de factores de transcripción llamados factores inducibles por hipoxia (HIF) y dirige las subunidades HIF-α a la degradación proteosomal. Por lo tanto, en células normales con suficiente oxígeno, se inhibe la transcripción de genes diana inducida por HIF-α. Durante la hipoxia, el HIF-α no se hidroxila y, por lo tanto, no es reconocido por la proteína VHL. Los HIF se trasladan al núcleo e inducen la transcripción de numerosos genes, muchos de los cuales codifican factores angiogénicos que estimulan el crecimiento de nuevos vasos (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). El crecimiento del cáncer requiere grandes cantidades de oxígeno y la mayoría de las células tumorales se encuentran en un estado constante de hipoxia.

Si no hay pVHL funcional en una célula, reacciona como si necesitara oxígeno, ya que los HIF estimularán la angiogénesis independientemente de los niveles de oxígeno. Por lo tanto, los pacientes con mutaciones de la línea germinal en el gen VHL pueden servir como modelo de angiogénesis inducida por hipoxia. Los pacientes con mutaciones de VHL en la línea germinal tienen enfermedad de von Hippel-Lindaus (vHL) y son propensos al desarrollo de tumores debido a este mecanismo, principalmente carcinoma de células renales y hemangioblastomas del sistema nervioso central (SNC) (Maher et al., 2011). Aunque los hemangioblastomas son tumores histológicamente benignos, pueden tener graves consecuencias. El desarrollo natural de los hemangioblastomas se caracteriza por períodos impredecibles de crecimiento y estancamiento. A menudo desarrollan quistes asociados que afectan el tejido nervioso adyacente y causan síntomas masivos, ya que incluso pequeños cambios de volumen en el cerebro pueden causar daño neurológico severo o incluso la muerte (Ammerman et al., 2006; Glasker et al., 2010; Wanebo et al. , 2003).

Los mecanismos detrás de la tumorigénesis asociada con vHL son complejos y aún no se conocen por completo. Un evento clave es la pérdida de un producto de proteína VHL funcional como resultado de la inactivación de ambos alelos del gen VHL de acuerdo con la hipótesis de dos aciertos de Knudson (Vortmeyer et al., 2013). Sin embargo, también está claro que aunque es necesaria la inactivación de ambas copias del gen VHL de una persona, no parece ser suficiente para el desarrollo del hemangioblastoma (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004). La inactivación de VHL bialélica puede estar presente en forma de múltiples precursores de tumores en los tejidos predispuestos, y la mayoría nunca se convierte en tumores causantes de síntomas reales (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004).

La pregunta clave para una mejor comprensión de cómo retardar o detener el desarrollo tumoral es la identificación de qué factores adicionales específicos inician o promueven el desarrollo y crecimiento tumoral. El desarrollo del tumor puede iniciarse en una sola célula que evade el control normal de la división celular, pero a medida que la célula se divide y multiplica, las células hijas pasan por una secuencia de múltiples eventos genéticos en muchos genes diferentes que se acumulan y brindan al tumor ventajas de crecimiento ( Hanahan y Weinberg, 2011). Esta secuencia de adenoma benigno a carcinoma maligno se ha mapeado previamente para el desarrollo del cáncer colorrectal y ha sido de gran importancia para nuestra comprensión actual del desarrollo del cáncer (Fearon y Vogelstein, 1990). En el caso de los hemangioblastomas, un mayor conocimiento sobre cualquier evento genético común en otros genes además del gen VHL que ocurre en las primeras etapas de la progresión del hemangioblastoma ayudará a determinar qué genes específicos pueden estar impulsando, es decir, promoviendo el crecimiento y/o el desarrollo de quistes.

Un grupo identificó recientemente la pérdida de HNF1B en el cromosoma 17q como un posible impulsor molecular de la tumorigénesis del hemangioblastoma mediante el análisis de la variación del número de copias en el ADN tumoral (Sun M et al., 2014). Otros grupos han encontrado evidencia de que la pérdida de ZAC1 en el cromosoma 6q juega un papel importante en la tumorigénesis del hemangioblastoma del SNC esporádico y asociado con vHL (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). Sin embargo, los enfoques más sistemáticos que investiguen las alteraciones genéticas de los hemangioblastomas desde una perspectiva más amplia podrían aumentar notablemente nuestro conocimiento de la secuencia de eventos genéticos que conducen desde los precursores de tumores en etapa temprana hasta los tumores completamente desarrollados. Este conocimiento es de gran importancia, tanto en relación con nuestra comprensión general de la tumorigénesis, como también en relación con la detección de los eventos genéticos tempranos necesarios que ocurren en todos los hemangioblastomas en las primeras etapas del desarrollo del tumor y pueden estar impulsando el proceso. Dichos eventos necesarios en las células precursoras de tumores pueden usarse como biomarcadores en biopsias de tejido o células tumorales que llegan al torrente sanguíneo para determinar qué pacientes tienen mayor riesgo de crecimiento tumoral agresivo. Finalmente, los cambios en genes específicos que se sabe que son pasos clave para convertir precursores de tumores en tumores clínicamente significativos serían candidatos obvios para el desarrollo de fármacos antitumorales.

Recientemente, las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) se han utilizado con éxito para determinar los perfiles genéticos y la secuencia de eventos genéticos específicos en relación con la progresión tumoral individual en muchos otros tipos de tumores, incluido el carcinoma de células renales (RCC) asociado con vHL y esporádico (Fisher et al., 2014;Gossage et al., 2015;Gundem et al., 2015;Kroigard et al., 2015). NGS hace posible examinar variaciones somáticas en el genoma completo de un tumor (es decir, variaciones que se han desarrollado específicamente en el ADN del tumor y no en el ADN de la línea germinal del paciente (Nik-Zainal, 2014).

Los investigadores del estudio plantean la hipótesis de que diferentes hemangioblastomas del SNC comparten alteraciones genéticas en genes específicos que promueven o inician el desarrollo tumoral a partir de células deficientes en VHL, es decir, impulsores genéticos del desarrollo tumoral. Los investigadores plantean además la hipótesis de que algunas de estas alteraciones genéticas representan pasos en la secuencia de progresión del hemangioblastoma. Al comparar las alteraciones genéticas en tumores en diferentes etapas de desarrollo, con diferentes patrones de crecimiento y con y sin desarrollo de quistes asociado, el investigador espera dilucidar las posibles alteraciones genéticas relacionadas con el desarrollo que ocurren en esta secuencia. Según la frecuencia con la que los tumores separados comparten las variantes genéticas, se puede estimar qué genes probablemente estén involucrados en las diferentes etapas del desarrollo del hemangioblastoma. En este proyecto piloto, los investigadores planean analizar tumores separados que se originan en el mismo paciente, así como tumores que se originan en diferentes pacientes para evaluar las diferencias dentro y entre pacientes.

Los hallazgos de conductores genéticos candidatos en este proyecto se confirmarán posteriormente en una serie más grande de hemangioblastomas del SNC tanto esporádicos como asociados con vHL, que se recopilarán en un proceso en curso. Además, los investigadores planean comparar los hallazgos con hallazgos recientes de conductores genéticos candidatos en carcinomas de células renales en un proyecto en curso realizado por algunos de nuestros colaboradores.

Material Los investigadores identificaron a pacientes daneses con vHL a través de múltiples registros nacionales de salud y pidieron a pacientes mayores de 18 años que participaran. Se entrevistó a los participantes que dieron su consentimiento sobre sus historias clínicas y se verificó la información a través de registros médicos.

Las mutaciones de la línea germinal de VHL de los participantes se identifican mediante el uso de ADN extraído de muestras de sangre periférica y, para este proyecto piloto, solo aquellos con una mutación patógena identificable de la línea germinal de VHL encontrada en el ADN de los linfocitos periféricos mediante secuenciación directa de exones y límites entre exón e intrón y MLPA. ser incluido.

En el estudio, se recolectarán muestras de tejido de todos los hemangioblastomas del SNC obtenibles que se hayan extirpado quirúrgicamente como parte del tratamiento de un participante, ya sea como tejido incluido en parafina, como tejido fresco congelado o como tejido fresco conservado en RNAlater.

Para el proyecto propuesto, se seleccionarán al menos dos hemangioblastomas del SNC alcanzables de cada participante mediante análisis NGS. Los investigadores esperan poder incluir ADN de al menos 19 muestras de tumores, incluido el ADN extraído de tejido tumoral incrustado en parafina, fresco congelado y tejido suspendido en RNAlater.

Métodos El ADN de cada participante se aísla del tejido tumoral y del tejido normal (es decir, sangre periférica) utilizando protocolos estándar. El tejido incluido en parafina puede contener tanto tejido tumoral como tejido circundante normal. Para asegurarse de que el ADN del tejido represente el ADN del tumor, los investigadores primero evaluarán las secciones teñidas con HE y se asegurarán de que > 85 % de la sección de tejido contenga tumor.

El enriquecimiento del exoma del ADN del tumor y del tejido normal se realizará utilizando un panel Niblegen de 64 Mb que incluye todos los genes conocidos, así como genes de miARN y lincARN. El ADN enriquecido se secuenciará utilizando la plataforma Illumina Hiseq1500 con secuenciación final emparejada de 2X100 bases y una tasa de cobertura media de 75-100x. Los resultados de cada muestra de ADN tumoral se compararán con el ADN del tejido normal del paciente para distinguir las variaciones de la línea germinal de las alteraciones genéticas específicas del tumor y así obtener el perfil de las alteraciones genéticas somáticas que pertenecen al ADN tumoral.

Las mutaciones somáticas se identificarán utilizando un software llamador de variantes somáticas como VarScan, Mutect, EBCall o Virmid. Se evaluarán las variantes somáticas identificadas ubicadas en el exoma del tumor y se identificarán los eventos del número de copias somáticas mediante el perfilado del número de copias de los datos de NGS utilizando el software ngCGH, Contra y Nexus. Las mutaciones puntuales somáticas identificadas se validarán mediante secuenciación profunda específica. Los investigadores seleccionarán las regiones cromosómicas candidatas en función de las variantes recurrentes en los tumores.

Las características clínicas de cada tumor antes de la extirpación quirúrgica se evaluarán mediante la evaluación de datos radiológicos en serie (IRM del SNC) de la vigilancia anual de cada participante y exámenes de diagnóstico adicionales:

1. Tamaño del tumor: evaluado por el volumen del tumor (ancho x largo x alto) x 0,5 (mm3)
2. Tiempo de desarrollo del tumor: evaluado por el intervalo de tiempo desde que el tumor fue visible por primera vez en la resonancia magnética hasta el momento de la cirugía
3. Tasa de crecimiento del tumor: evaluada por progresión radiológica, es decir, cambio en el volumen del tumor/intervalo de tiempo entre dos resonancias magnéticas (meses)
4. Fase de crecimiento del tumor: evaluada según la fase de crecimiento en la que se encontraba el tumor antes de la cirugía (fase de crecimiento frente a estancamiento definida por el cambio en el volumen del tumor en los intervalos de tiempo entre las últimas tres resonancias magnéticas)
5. Desarrollo de quiste asociado y tamaño del quiste antes de la cirugía: Evaluado por el volumen del quiste en la última resonancia magnética antes de la cirugía.

Esta información clínica se comparará con el perfil genético del tumor para evaluar cualquier asociación clínica con posibles impulsores moleculares.