Драйверы индуцированного гипоксией ангиогенеза в развитии опухоли

Фон Развитие раковых клеток требует ряда приобретенных способностей для роста и распространения: 1) самодостаточность сигналов роста, 2) нечувствительность к сигналам ингибирования роста, 3) уклонение от апоптоза (запрограммированная гибель клеток), 4) безграничный репликативный потенциал, 5 ) устойчивый ангиогенез и 6) инвазия тканей и метастазирование (Hanahan and Weinberg, 2000). Приобретение этих возможностей обусловлено мутациями в ключевых онкогенах и генах-супрессорах опухолей, хотя точные механизмы еще полностью не изучены. В частности, ангиогенез имеет решающее значение для выживания клетки, поскольку ее непрерывное размножение зависит от кислорода и питательных веществ, поступающих в сосудистую сеть (Hanahan and Weinberg, 2000). Ангиогенез может быть инициирован недостатком кислорода (гипоксией), а чувствительный к кислороду путь клетки опосредует реакцию. В нормальных условиях и в присутствии кислорода белок VHL, pVHL, опосредует связывание комплекса убиквитинлигазы с группой факторов транскрипции, называемых факторами, индуцируемыми гипоксией (HIF), и направляет субъединицы HIF-α на протеосомную деградацию. Таким образом, в нормальных клетках с достаточным количеством кислорода индуцированная HIF-α транскрипция генов-мишеней ингибируется. Во время гипоксии HIF-α не гидроксилируется и поэтому не распознается белком VHL. HIF перемещаются в ядро ​​и индуцируют транскрипцию многочисленных генов, многие из которых кодируют ангиогенные факторы, стимулирующие рост новых сосудов (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). Рост рака требует огромного количества кислорода, и большинство опухолевых клеток находятся в постоянном состоянии гипоксии.

Если в клетке нет функциональной pVHL, она реагирует так, как будто ей нужен кислород, поскольку HIF будут стимулировать ангиогенез независимо от уровня кислорода. Следовательно, пациенты с зародышевыми мутациями в гене VHL могут служить моделью индуцированного гипоксией ангиогенеза. Пациенты с зародышевыми мутациями VHL имеют болезнь фон Гиппеля-Линдауса (vHL) и склонны к развитию опухолей из-за этого механизма, в основном почечно-клеточного рака и гемангиобластом центральной нервной системы (ЦНС) (Maher et al., 2011). Хотя гемангиобластомы являются гистологически доброкачественными опухолями, они могут иметь серьезные последствия. Естественное развитие гемангиобластом характеризуется непредсказуемыми периодами роста и застоя. Часто у них развиваются ассоциированные кисты, которые поражают соседние нервные ткани и вызывают массивные симптомы, так как даже небольшие объемные изменения в головном мозге могут вызвать тяжелые неврологические повреждения или даже смерть (Ammerman et al., 2006; Glasker et al., 2010; Wanebo et al. , 2003).

Механизмы, лежащие в основе онкогенеза, связанного с vHL, сложны и до конца не изучены. Ключевым событием является потеря функционального белкового продукта VHL в результате инактивации обоих аллелей гена VHL в соответствии с гипотезой двух попаданий Кнудсона (Vortmeyer et al., 2013). Однако также ясно, что хотя инактивация обеих копий гена VHL человека необходима, этого недостаточно для развития гемангиобластомы (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004). Биаллельная инактивация VHL может присутствовать в виде множественных предшественников опухоли в предрасположенных тканях и в большинстве случаев никогда не превращается в фактически вызывающие симптомы опухоли (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004).

Ключевым вопросом для лучшего понимания того, как замедлить или остановить развитие опухоли, является определение того, какие специфические дополнительные факторы инициируют или способствуют развитию и росту опухоли. Развитие опухоли может быть инициировано в одной клетке, которая ускользает от нормального контроля над клеточным делением, но по мере того, как клетка делится и размножается, дочерние клетки проходят через последовательность множественных генетических событий во многих различных генах, которые накапливаются и обеспечивают рост опухоли. Ханахан и Вайнберг, 2011). Такая последовательность от доброкачественной аденомы до злокачественной карциномы ранее была картирована для развития колоректального рака и имеет огромное значение для нашего современного понимания развития рака (Fearon and Vogelstein, 1990). В случае гемангиобластом дополнительные знания о любых общих генетических событиях в других генах, кроме гена VHL, которые происходят на ранних стадиях прогрессирования гемангиобластомы, помогут определить, какие конкретные гены могут быть движущими, т.е. способствующими росту и/или развитию кисты.

Одна группа недавно идентифицировала потерю HNF1B на хромосоме 17q как потенциальную молекулярную движущую силу онкогенеза гемангиобластомы с использованием анализа вариации числа копий в опухолевой ДНК (Sun M et al., 2014). Другие группы обнаружили доказательства того, что потеря ZAC1 на хромосоме 6q играет важную роль как в vHL-ассоциированном, так и в спорадическом онкогенезе гемангиобластомы ЦНС (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). Тем не менее, более систематические подходы к изучению генетических изменений гемангиобластом в более широкой перспективе могут заметно расширить наши знания о последовательности генетических событий, ведущих от предшественников опухоли на ранней стадии к полностью выросшим опухолям. Эти знания имеют огромное значение как в связи с нашим общим пониманием онкогенеза, так и в отношении раннего выявления необходимых генетических событий, которые происходят во всех гемангиобластомах на ранних стадиях развития опухоли и могут быть движущей силой процесса. Такие необходимые события в клетках-предшественниках опухоли можно использовать в качестве биомаркеров в биопсиях тканей или опухолевых клетках, которые попадают в кровоток, чтобы определить, какие пациенты наиболее подвержены риску агрессивного роста опухоли. Наконец, изменения в специфических генах, которые, как известно, являются ключевыми шагами в превращении предшественников опухолей в клинически значимые опухоли, могут быть очевидными кандидатами для разработки противоопухолевых препаратов.

В последнее время методы секвенирования нового поколения (NGS) успешно использовались для определения генетических профилей и последовательности специфических генетических событий в отношении индивидуальной прогрессии опухоли при множестве других типов опухолей, включая как спорадическую, так и vHL-ассоциированную почечно-клеточную карциному (RCC) (Fisher). et al., 2014; Gossage et al., 2015; Gundem et al., 2015; Kroigard et al., 2015). NGS позволяет исследовать соматические вариации всего генома опухоли (т.е. вариации, которые развились именно в ДНК опухоли, а не в ДНК зародышевой линии пациента) (Nik-Zainal, 2014).

Исследователи предполагают, что разные гемангиобластомы ЦНС имеют общие генетические изменения в определенных генах, которые способствуют или инициируют развитие опухоли из клеток с дефицитом VHL, то есть генетических факторов развития опухоли. Исследователи также предполагают, что некоторые из этих генетических изменений представляют собой этапы последовательности прогрессирования гемангиобластомы. Путем сравнения генетических изменений в опухолях на разных стадиях развития, с разными моделями роста, а также с ассоциированным развитием кист и без него, исследователи надеются выяснить возможные генетические изменения, связанные с развитием, которые происходят в этой последовательности. Основываясь на том, как часто генетические варианты являются общими для отдельных опухолей, можно оценить, какие гены, вероятно, участвуют на разных стадиях развития гемангиобластомы. В этом пилотном проекте исследователи планируют проанализировать отдельные опухоли, происходящие от одного и того же пациента, а также опухоли, происходящие от разных пациентов, чтобы оценить различия внутри и между пациентами.

Выводы потенциальных генетических драйверов в этом проекте впоследствии будут подтверждены в более крупной серии как vHL-ассоциированных, так и спорадических гемангиобластом ЦНС, которые будут собираться в ходе текущего процесса. Кроме того, исследователи планируют сравнить результаты с недавними открытиями потенциальных генетических драйверов почечно-клеточного рака в текущем проекте, выполняемом некоторыми из наших сотрудников.

Материал Исследователи идентифицировали датских пациентов с vHL через несколько национальных регистров здоровья и попросили пациентов старше 18 лет принять участие. Давшие согласие участники были опрошены об их историях болезни, и информация была проверена с помощью медицинских записей.

Мутации зародышевой линии VHL участников идентифицируют с использованием ДНК, извлеченной из образцов периферической крови, и для этого пилотного проекта только те, у кого идентифицируемая патогенная мутация зародышевой линии VHL обнаружена в ДНК из периферических лимфоцитов с использованием прямого секвенирования экзонов и экзон-интронных границ и MLPA. быть включенным.

В исследовании будут собраны образцы тканей всех доступных гемангиобластом ЦНС, которые были удалены хирургическим путем в рамках лечения участника, либо в виде ткани, залитой в парафин, либо в виде свежезамороженной ткани, либо в виде свежей ткани, законсервированной в RNAlater.

Для предлагаемого проекта анализом NGS будут выбраны не менее двух достижимых гемангиобластом ЦНС от каждого участника. Исследователи ожидают, что смогут включить ДНК как минимум из 19 образцов опухолей, включая ДНК, выделенную из опухолевой ткани, залитой в парафин, свежезамороженной и суспендированной в РНК-латере ткани.

Методы ДНК каждого участника выделяют из опухолевой ткани и из нормальной ткани (т.е. периферическая кровь) по стандартным протоколам. Залитая парафином ткань может содержать как опухолевые, так и нормальные окружающие ткани. Чтобы убедиться, что ДНК из ткани представляет ДНК опухоли, исследователи сначала оценят срезы, окрашенные HE, и удостоверятся, что> 85% среза ткани содержит опухоль.

Экзомное обогащение ДНК как опухоли, так и нормальной ткани будет выполняться с использованием панели Niblegen 64Mb, включающей все известные гены, а также гены miRNA и lincRNA. Обогащенная ДНК будет секвенирована с использованием платформы Illumina Hiseq1500 с парным секвенированием концов 2X100 оснований и средней степенью охвата 75-100x. Результаты каждого образца ДНК опухоли будут сравниваться с ДНК нормальной ткани пациента, чтобы отличить вариации зародышевой линии от генетических изменений, специфичных для опухоли, и, таким образом, получить профиль соматических генетических изменений, принадлежащих ДНК опухоли.

Соматические мутации будут идентифицированы с помощью программного обеспечения для вызова соматических вариантов, такого как VarScan, Mutect, EBCall или Virmid. Будут оценены идентифицированные соматические варианты, расположенные в экзоме опухоли, и события числа соматических копий будут идентифицированы посредством профилирования числа копий данных NGS с использованием программного обеспечения ngCGH, Contra и Nexus. Выявленные соматические точечные мутации будут подтверждены с помощью целевого глубокого секвенирования. Исследователи выберут хромосомные области-кандидаты на основе повторяющихся вариантов в опухолях.

Клинические характеристики каждой опухоли до хирургического удаления будут оцениваться путем оценки серийных радиологических данных (МРТ ЦНС) ежегодного наблюдения каждого участника в течение года и дополнительных диагностических обследований:

1. Размер опухоли: оценивается по объему опухоли (ширина x длина x высота) x 0,5 (мм3)
2. Время развития опухоли: оценивается по временному интервалу от появления опухоли на МРТ до момента операции.
3. Скорость роста опухоли: оценивается по радиологической прогрессии, т. е. изменению объема опухоли/временному интервалу между двумя МРТ (месяцы).
4. Фаза роста опухоли: оценивается по тому, в какой фазе роста находилась опухоль до операции (фаза застоя по сравнению с фазой роста определяется изменением объема опухоли в промежутках времени между последними тремя МРТ).
5. Сопутствующее развитие кисты и размер кисты до операции: оценивали по объему кисты на последней МРТ перед операцией.

Эта клиническая информация будет сравниваться с генетическим профилем опухоли, чтобы оценить любые клинические ассоциации с возможными молекулярными факторами.