Hnací mechanismy hypoxií indukované angiogeneze ve vývoji nádoru

Pozadí Vývoj rakovinných buněk vyžaduje řadu získaných schopností růstu a šíření: 1) soběstačnost v růstových signálech, 2) necitlivost na signály inhibice růstu, 3) vyhýbání se apoptóze (programovaná buněčná smrt), 4) neomezený replikační potenciál, 5 ) trvalá angiogeneze a 6) tkáňová invaze a metastázy (Hanahan a Weinberg, 2000). Získání těchto schopností je řízeno mutacemi v klíčových onkogenech a supresorových genech nádorů, ačkoli přesné mechanismy ještě nejsou plně objasněny. Zvláště angiogeneze je rozhodující pro přežití buňky, protože její pokračující množení závisí na kyslíku a živinách dodávaných ve vaskulatuře (Hanahan a Weinberg, 2000). Angiogeneze může být zahájena nedostatkem kyslíku (hypoxie) a buněčná dráha snímání kyslíku zprostředkovává odpověď. Za normálních podmínek a za přítomnosti kyslíku protein VHL, pVHL zprostředkovává vazbu komplexu ubikvitin ligázy na skupinu transkripčních faktorů nazývaných hypoxií indukovatelné faktory (HIFs) a řídí podjednotky HIF-α k proteosomální degradaci. V normálních buňkách s dostatkem kyslíku je tedy HIF-a-indukovaná transkripce cílových genů inhibována. Během hypoxie není HIF-α hydroxylován, a proto není rozpoznán proteinem VHL. HIF se translokují do jádra a indukují transkripci četných genů, mnohé kódující angiogenní faktory, které stimulují růst nových cév (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). Růst rakoviny vyžaduje obrovské množství kyslíku a většina nádorových buněk je v konstantním stavu hypoxie.

Pokud v buňce není funkční pVHL, reaguje, jako by potřebovala kyslík, protože HIF budou stimulovat angiogenezi bez ohledu na hladiny kyslíku. Proto mohou pacienti se zárodečnými mutacemi v genu VHL sloužit jako model hypoxií indukované angiogeneze. Pacienti se zárodečnými mutacemi VHL mají von Hippel-Lindausovu chorobu (vHL) a jsou náchylní k rozvoji nádorů díky tomuto mechanismu, zejména karcinomu ledvin a hemangioblastomů centrálního nervového systému (CNS) (Maher et al., 2011). I když jsou hemangioblastomy histologicky benigní nádory, mohou mít vážné následky. Přirozený vývoj hemangioblastomů je charakterizován nepředvídatelnými obdobími růstu a stagnace. Často se u nich vyvinou přidružené cysty, které postihují přilehlou nervovou tkáň a způsobují masivní symptomy, protože i malé objemové změny v mozku mohou způsobit vážné neurologické poškození nebo dokonce smrt (Ammerman et al., 2006; Glasker et al., 2010; Wanebo et al. , 2003).

Mechanismy za vHL-asociovanou tumorgenezí jsou složité a dosud ne zcela pochopené. Klíčovou událostí je ztráta funkčního proteinového produktu VHL v důsledku inaktivace obou alel genu VHL v souladu s Knudsonovou hypotézou dvou zásahů (Vortmeyer et al., 2013). Je však také jasné, že i když je inaktivace obou kopií genu VHL u osoby nezbytná, nezdá se, že by postačovala pro rozvoj hemangioblastomu (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004). Bialelická inaktivace VHL může být přítomna ve formě mnoha nádorových prekurzorů v predisponovaných tkáních a většinou se nikdy nevyvine do skutečných nádorů způsobujících symptomy (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004).

Klíčovou otázkou pro lepší pochopení toho, jak zpomalit nebo zastavit vývoj nádoru, je identifikace toho, které specifické další faktory iniciují nebo podporují vývoj a růst nádoru. Vývoj nádoru může být zahájen v jediné buňce, která se vyhýbá normální kontrole buněčného dělení, ale jak se buňka dělí a množí, dceřiné buňky procházejí sekvencí mnoha genetických událostí v mnoha různých genech, které se hromadí a poskytují nádoru růstové výhody. Hanahan a Weinberg, 2011). Taková sekvence od benigního adenomu k malignímu karcinomu byla již dříve mapována pro vývoj kolorektálního karcinomu a měla nesmírný význam pro naše současné chápání vývoje rakoviny (Fearon a Vogelstein, 1990). V případě hemangioblastomů další znalosti o jakýchkoli běžných genetických událostech v jiných genech než genu VHL, které se vyskytují v raných fázích progrese hemangioblastomu, pomohou určit, které specifické geny mohou být hnací silou, tj. podporovat růst a/nebo vývoj cyst.

Jedna skupina nedávno identifikovala ztrátu HNF1B na chromozomu 17q jako potenciální molekulární hnací sílu tumorigeneze hemangioblastomu pomocí analýzy variace počtu kopií v nádorové DNA (Sun M et al., 2014). Jiné skupiny našly důkazy, že ztráta ZAC1 na chromozomu 6q hraje hlavní roli v tumorigenezi hemangioblastomu CNS spojeného s vHL i sporadickém (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). Systematičtější přístupy zkoumající genetické změny hemangioblastomů v širší perspektivě by však mohly výrazně rozšířit naše znalosti o posloupnosti genetických událostí vedoucích od časných stádií nádorových prekurzorů k plně rozvinutým nádorům. Tyto znalosti jsou nesmírně důležité, a to jak ve vztahu k našemu obecnému chápání tumorigeneze, ale také ve vztahu k detekci časných nezbytných genetických událostí, které se vyskytují u všech hemangioblastomů v časných stádiích vývoje tumoru a mohou být hnací silou procesu. Takové nezbytné události v nádorových prekurzorových buňkách mohou být použity jako biomarkery v tkáňových biopsiích nebo nádorových buňkách, které se dostanou do krevního řečiště, aby se určilo, kteří pacienti jsou nejvíce ohroženi agresivním růstem nádoru. Konečně, změny ve specifických genech, o kterých je známo, že jsou klíčovými kroky při přeměně nádorových prekurzorů na klinicky významné nádory, by byly zřejmými kandidáty, na které by se měl zaměřit vývoj protinádorových léků.

Nedávno byly techniky sekvenování nové generace (NGS) úspěšně použity ke stanovení genetických profilů a sekvence specifických genetických událostí ve vztahu k individuální progresi nádoru u mnoha dalších typů nádorů, včetně jak sporadického, tak i vHL-asociovaného renálního karcinomu (RCC) (Fisher a kol., 2014; Gossage a kol., 2015; Gundem a kol., 2015; Kroigard a kol., 2015). NGS umožňuje zkoumat somatické variace v celém genomu nádoru (tj. variace, které se vyvinuly specificky v DNA nádoru a ne v zárodečné DNA pacienta) (Nik-Zainal, 2014).

Autoři studie předpokládají, že různé hemangioblastomy CNS sdílejí genetické změny ve specifických genech, které podporují nebo iniciují vývoj nádoru z buněk s deficitem VHL, tj. genetické ovladače vývoje nádoru. Vyšetřovatelé dále předpokládají, že některé z těchto genetických změn představují kroky v sekvenci progrese hemangioblastomu. Porovnáním genetických změn v nádorech v různých stádiích vývoje, s různými vzory růstu as přidruženým vývojem cyst a bez něj, se výzkumník snaží objasnit možné genetické změny související s vývojem, které se vyskytují v této sekvenci. Na základě toho, jak často jsou genetické varianty sdíleny jednotlivými nádory, lze odhadnout, které geny se pravděpodobně účastní v různých fázích vývoje hemangioblastomu. V tomto pilotním projektu vyšetřovatelé plánují analyzovat samostatné nádory pocházející od stejného pacienta a také nádory pocházející od různých pacientů, aby vyhodnotili rozdíly mezi pacienty a mezi nimi.

Nálezy kandidátních genetických ovladačů v tomto projektu budou následně potvrzeny ve větší sérii jak vHL-asociovaných, tak sporadických hemangioblastomů CNS, které budou shromažďovány v probíhajícím procesu. Vyšetřovatelé také plánují porovnat zjištění s nedávnými nálezy kandidátských genetických ovladačů u karcinomů ledvin v probíhajícím projektu prováděném některými našimi spolupracovníky.

Materiál Vyšetřovatelé identifikovali dánské pacienty s vHL prostřednictvím mnoha národních zdravotních registrů a požádali pacienty starší 18 let, aby se zúčastnili. Souhlasící účastníci byli dotazováni na jejich anamnézu a informace byly ověřeny prostřednictvím lékařských záznamů.

Mutace zárodečné linie VHL účastníků jsou identifikovány pomocí DNA extrahované ze vzorků periferní krve a pro tento pilotní projekt budou určeny pouze ty s identifikovatelnou patogenní mutací zárodečné linie VHL nalezenou v DNA z periferních lymfocytů pomocí přímého sekvenování exonů a hranic exon-intron a MLPA. být zahrnut.

Ve studii budou odebrány vzorky tkáně ze všech dostupných hemangioblastomů CNS, které byly chirurgicky odstraněny jako součást léčby účastníka, buď jako tkáň zalitá v parafínu, jako čerstvá zmrazená tkáň nebo jako čerstvá tkáň konzervovaná v RNAlater.

Pro navrhovaný projekt budou vybrány alespoň dva dosažitelné hemangioblastomy CNS od každého účastníka NGS analýza. Vyšetřovatelé očekávají, že budou schopni zahrnout DNA z alespoň 19 vzorků nádorů, včetně DNA extrahované z nádorové tkáně zalité v parafínu, čerstvé zmrazené a tkáně suspendované v RNAlater.

Metody DNA od každého účastníka je izolována z nádorové tkáně a z normální tkáně (tj. periferní krve) pomocí standardních protokolů. Tkáň zalitá v parafínu může obsahovat jak nádorovou tkáň, tak i normální okolní tkáň. Aby se zajistilo, že DNA z tkáně představuje nádorovou DNA, vyšetřovatelé nejprve vyhodnotí řezy obarvené HE a zajistí, že > 85 % řezu tkáně obsahuje nádor.

Exomové obohacení DNA nádoru i normální tkáně bude provedeno pomocí panelu Niblegen 64Mb zahrnujícího všechny známé geny a také geny miRNA a lincRNA. Obohacená DNA bude sekvenována pomocí platformy Illumina Hiseq1500 se sekvenováním párových konců 2X100 bází a střední mírou pokrytí 75-100x. Výsledky z každého vzorku nádorové DNA budou porovnány s DNA normální tkáně pacienta, aby se odlišily zárodečné variace od nádorově specifických genetických změn, a tak se získal profil somatických genetických změn náležejících k nádorové DNA.

Somatické mutace budou identifikovány pomocí softwaru pro volání somatických variant, jako je VarScan, Mutect, EBCall nebo Virmid. Budou hodnoceny identifikované somatické varianty lokalizované v exomu nádoru a události počtu somatických kopií budou identifikovány pomocí profilování počtu kopií dat NGS pomocí softwaru ngCGH, Contra a Nexus. Identifikované somatické bodové mutace budou validovány pomocí cíleného hlubokého sekvenování. Výzkumníci vyberou chromozomální kandidátní oblasti na základě rekurentních variant napříč nádory.

Klinické charakteristiky každého nádoru před chirurgickým odstraněním budou hodnoceny prostřednictvím vyhodnocení sériových radiologických dat (MRI CNS) z ročního ročního sledování každého účastníka a dalších diagnostických vyšetření:

1. Velikost nádoru: Stanoveno podle objemu nádoru (šířka x délka x výška) x 0,5 (mm3)
2. Doba vývoje nádoru: Hodnotí se časový interval od prvního patrného nádoru na MRI do doby operace
3. Rychlost růstu nádoru: Hodnotí se radiologickou progresí, tj. změnou objemu nádoru/časového intervalu mezi dvěma MRI (měsíce)
4. Fáze růstu nádoru: Posouzeno, ve které fázi růstu se nádor nacházel před operací (stagnující vs. růstová fáze definovaná změnou objemu nádoru v časových intervalech mezi posledními třemi MRI)
5. Související vývoj cysty a velikost cysty před operací: Hodnotí se podle objemu cysty na poslední MRI před operací.

Tato klinická informace bude porovnána s genetickým profilem nádoru, aby bylo možné posoudit jakékoli klinické asociace s možnými molekulárními faktory.