Czynniki napędzające angiogenezę wywołaną niedotlenieniem w rozwoju guza

Wstęp Rozwój komórek nowotworowych wymaga szeregu nabytych zdolności do wzrostu i rozprzestrzeniania się: 1) samowystarczalności w zakresie sygnałów wzrostu, 2) niewrażliwości na sygnały hamowania wzrostu, 3) unikania apoptozy (zaprogramowanej śmierci komórki), 4) nieograniczonego potencjału replikacyjnego, 5 ) przedłużona angiogeneza i 6) inwazja tkanek i przerzuty (Hanahan i Weinberg, 2000). Nabycie tych zdolności jest napędzane mutacjami w kluczowych onkogenach i genach supresorowych nowotworów, chociaż dokładne mechanizmy nie są jeszcze w pełni poznane. Szczególnie angiogeneza ma kluczowe znaczenie dla przeżycia komórki, ponieważ jej dalsze namnażanie zależy od tlenu i składników odżywczych dostarczanych przez układ naczyniowy (Hanahan i Weinberg, 2000). Angiogeneza może zostać zainicjowana przez brak tlenu (niedotlenienie), a szlak wykrywania tlenu w komórce pośredniczy w odpowiedzi. W normalnych warunkach iw obecności tlenu białko VHL, pVHL pośredniczy w wiązaniu kompleksu ligazy ubikwityny z grupą czynników transkrypcyjnych zwanych czynnikami indukowanymi hipoksją (HIF) i kieruje podjednostki HIF-α do degradacji proteosomów. Zatem w normalnych komórkach z wystarczającą ilością tlenu indukowana przez HIF-α transkrypcja docelowych genów jest hamowana. Podczas niedotlenienia HIF-α nie ulega hydroksylacji i dlatego nie jest rozpoznawany przez białko VHL. HIF przemieszczają się do jądra i indukują transkrypcję wielu genów, z których wiele koduje czynniki angiogenne, które stymulują wzrost nowych naczyń (Maher i in., 2011; Nordstrom-O'Brien i in., 2010). Wzrost raka wymaga ogromnych ilości tlenu, a większość komórek nowotworowych jest w ciągłym stanie niedotlenienia.

Jeśli w komórce nie ma funkcjonalnego pVHL, komórka reaguje tak, jakby potrzebowała tlenu, ponieważ HIF będą stymulować angiogenezę niezależnie od poziomu tlenu. Dlatego pacjenci z mutacjami germinalnymi w genie VHL mogą służyć jako model angiogenezy indukowanej niedotlenieniem. Pacjenci z zarodkowymi mutacjami VHL cierpią na chorobę von Hippla-Lindausa (vHL) i są podatni na rozwój nowotworów z powodu tego mechanizmu, głównie raka nerkowokomórkowego i naczyniaków zarodkowych ośrodkowego układu nerwowego (Maher i in., 2011). Chociaż naczyniaki zarodkowe są histologicznie łagodnymi nowotworami, mogą mieć poważne konsekwencje. Naturalny rozwój naczyniaków zarodkowych charakteryzuje się nieprzewidywalnymi okresami wzrostu i stagnacji. Często towarzyszą im torbiele, które wpływają na sąsiednią tkankę nerwową i powodują masowe objawy, ponieważ nawet niewielkie zmiany objętości w mózgu mogą spowodować poważne uszkodzenie neurologiczne, a nawet śmierć (Ammerman i in., 2006; Glasker i in., 2010; Wanebo i in. , 2003).

Mechanizmy powstawania nowotworów związane z vHL są złożone i nie zostały jeszcze w pełni poznane. Kluczowym zdarzeniem jest utrata funkcjonalnego produktu białkowego VHL w wyniku inaktywacji obu alleli genu VHL zgodnie z hipotezą dwóch trafień Knudsona (Vortmeyer et al., 2013). Jednak jasne jest również, że chociaż konieczna jest inaktywacja obu kopii genu VHL danej osoby, nie wydaje się ona wystarczająca do rozwoju naczyniaka zarodkowego (Vortmeyer i in., 2013; Vortmeyer i in., 2006; Vortmeyer i in., 2004). Bialleliczna inaktywacja VHL może być obecna w postaci wielu prekursorów nowotworów w predysponowanych tkankach, a większość nigdy nie rozwija się w rzeczywiste guzy powodujące objawy (Vortmeyer i in., 2013; Vortmeyer i in., 2006; Vortmeyer i in., 2004).

Kluczową kwestią dla lepszego zrozumienia, w jaki sposób spowolnić lub zatrzymać rozwój guza, jest określenie, które dodatkowe czynniki inicjują lub promują rozwój i wzrost guza. Rozwój nowotworu może zostać zapoczątkowany w pojedynczej komórce, która wymyka się normalnej kontroli podziału komórkowego, ale gdy komórka dzieli się i mnoży, komórki potomne przechodzą przez sekwencję wielu zdarzeń genetycznych w wielu różnych genach, które gromadzą się i zapewniają wzrost nowotworu. Hanahan i Weinberg, 2011). Taka sekwencja od łagodnego gruczolaka do złośliwego raka została wcześniej zmapowana pod kątem rozwoju raka jelita grubego i miała ogromne znaczenie dla naszego obecnego zrozumienia rozwoju raka (Fearon i Vogelstein, 1990). W przypadku naczyniaków zarodkowych dalsza wiedza na temat wszelkich wspólnych zdarzeń genetycznych w genach innych niż gen VHL, które występują we wczesnych stadiach progresji naczyniaka zarodkowego, pomoże określić, które konkretne geny mogą być motorem, tj. promowaniem wzrostu i/lub rozwojem torbieli.

Jedna grupa niedawno zidentyfikowała utratę HNF1B na chromosomie 17q jako potencjalny molekularny czynnik prowadzący do powstania nowotworu naczyniaka krwionośnego za pomocą analizy zmienności liczby kopii w DNA guza (Sun M i in., 2014). Inne grupy znalazły dowody na to, że utrata ZAC1 na chromosomie 6q odgrywa główną rolę w powstawaniu nowotworu hemangioblastomy ośrodkowego układu nerwowego zarówno związanego z vHL, jak i sporadycznego (Lemeta i in., 2007; Zhou i in., 2010). Jednak bardziej systematyczne podejście do badania zmian genetycznych naczyniaków zarodkowych w szerszej perspektywie mogłoby znacznie zwiększyć naszą wiedzę na temat sekwencji zdarzeń genetycznych prowadzących od wczesnych stadiów prekursorów nowotworu do w pełni rozwiniętych guzów. Wiedza ta ma ogromne znaczenie, zarówno w odniesieniu do naszego ogólnego zrozumienia powstawania nowotworów, ale także w odniesieniu do wykrywania wczesnych niezbędnych zdarzeń genetycznych, które występują we wszystkich naczyniakach zarodkowych we wczesnych stadiach rozwoju guza i mogą napędzać ten proces. Takie niezbędne zdarzenia w komórkach prekursorowych guza można wykorzystać jako biomarkery w biopsjach tkanek lub komórkach nowotworowych, które przedostają się do krwioobiegu, aby określić, którzy pacjenci są najbardziej narażeni na agresywny wzrost guza. Wreszcie, zmiany w określonych genach, o których wiadomo, że są kluczowymi krokami w przekształcaniu prekursorów guza w guzy o znaczeniu klinicznym, byłyby oczywistymi kandydatami do celu w opracowywaniu leków przeciwnowotworowych.

Ostatnio techniki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zostały z powodzeniem zastosowane do określenia profili genetycznych i sekwencji określonych zdarzeń genetycznych w odniesieniu do indywidualnej progresji nowotworu w wielu innych typach nowotworów, w tym zarówno sporadycznym, jak i związanym z vHL rakiem nerkowokomórkowym (RCC) (Fisher i in., 2014; Gossage i in., 2015; Gundem i in., 2015; Kroigard i in., 2015). NGS umożliwia badanie zmian somatycznych w całym genomie guza (tj. zmiany, które rozwinęły się specyficznie w DNA guza, a nie w DNA linii zarodkowej pacjenta) (Nik-Zainal, 2014).

Badacze postawili hipotezę, że różne naczyniaki zarodkowe OUN mają wspólne zmiany genetyczne w określonych genach, które promują lub inicjują rozwój nowotworu z komórek z niedoborem VHL, tj. genetyczne czynniki napędzające rozwój nowotworu. Badacze wysuwają ponadto hipotezę, że niektóre z tych zmian genetycznych reprezentują etapy w sekwencji progresji naczyniaka zarodkowego. Porównując zmiany genetyczne w guzach na różnych etapach rozwoju, z różnymi wzorami wzrostu oraz z towarzyszącym rozwojem torbieli i bez niego, badacze starają się wyjaśnić możliwe zmiany genetyczne związane z rozwojem, które występują w tej sekwencji. Na podstawie tego, jak często warianty genetyczne są wspólne dla poszczególnych guzów, można oszacować, które geny są prawdopodobnie zaangażowane na różnych etapach rozwoju naczyniaka krwionośnego. W tym projekcie pilotażowym badacze planują przeanalizować oddzielne guzy pochodzące od tego samego pacjenta, jak również guzy pochodzące od różnych pacjentów, aby ocenić różnice wewnątrz- i między pacjentami.

Ustalenia kandydatów na genetyczne czynniki genetyczne w tym projekcie zostaną następnie potwierdzone w większej serii zarówno związanych z vHL, jak i sporadycznych naczyniaków zarodkowych OUN, które zostaną zebrane w ramach trwającego procesu. Badacze planują również porównać wyniki z najnowszymi odkryciami kandydatów na genetyczne czynniki w raku nerkowokomórkowym w ramach trwającego projektu realizowanego przez niektórych z naszych współpracowników.

Materiał Badacze zidentyfikowali duńskich pacjentów z vHL za pomocą wielu krajowych rejestrów zdrowia i poprosili pacjentów w wieku powyżej 18 lat o udział. Uczestnicy, którzy wyrazili zgodę, zostali przesłuchani na temat ich historii medycznej i informacji zweryfikowanych za pomocą dokumentacji medycznej.

Mutacje linii zarodkowej VHL uczestników są identyfikowane za pomocą DNA wyekstrahowanego z próbek krwi obwodowej, a w tym projekcie pilotażowym tylko osoby z możliwą do zidentyfikowania patogenną mutacją linii zarodkowej VHL stwierdzoną w DNA z limfocytów obwodowych przy użyciu bezpośredniego sekwencjonowania eksonów i granic ekson-intron oraz MLPA, będą być uwzględnionym.

W badaniu zostaną pobrane próbki tkanek ze wszystkich możliwych do uzyskania naczyniaków zarodkowych OUN, które zostały usunięte chirurgicznie w ramach leczenia uczestnika, albo jako tkanka zatopiona w parafinie, jako świeżo zamrożona tkanka lub jako świeża tkanka zakonserwowana w RNAlater.

Do proponowanego projektu zostaną wybrane co najmniej dwa osiągalne naczyniaki zarodkowe OUN od każdego uczestnika do analizy NGS. Badacze spodziewają się, że będą w stanie uwzględnić DNA z co najmniej 19 próbek guza, w tym DNA wyekstrahowane zarówno z tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie, świeżo zamrożonej, jak i tkanki zawieszonej w RNAlater.

Metody DNA od każdego uczestnika jest izolowane z tkanki nowotworowej oraz z tkanki prawidłowej (tj. krwi obwodowej) przy użyciu standardowych protokołów. Tkanka zatopiona w parafinie może zawierać zarówno tkankę nowotworową, jak i normalną tkankę otaczającą. Aby upewnić się, że DNA z tkanki reprezentuje DNA guza, badacze najpierw ocenią skrawki barwione HE i upewnią się, że > 85% skrawka tkanki zawiera guz.

Wzbogacenie egzomu zarówno DNA tkanki nowotworowej, jak i prawidłowej zostanie przeprowadzone przy użyciu panelu Niblegen 64Mb zawierającego wszystkie znane geny, jak również geny miRNA i lincRNA. Wzbogacony DNA zostanie zsekwencjonowany przy użyciu platformy Illumina Hiseq1500 z sekwencjonowaniem par końców 2X100 zasad i średnim współczynnikiem pokrycia 75-100 x. Wyniki z każdej próbki DNA nowotworu zostaną porównane z DNA normalnej tkanki pacjenta w celu odróżnienia zmienności linii zarodkowej od zmian genetycznych specyficznych dla nowotworu, a tym samym uzyskania profilu somatycznych zmian genetycznych należących do DNA nowotworu.

Mutacje somatyczne zostaną zidentyfikowane za pomocą oprogramowania do wywoływania wariantów somatycznych, takiego jak VarScan, Mutect, EBCall lub Virmid. Zidentyfikowane warianty somatyczne zlokalizowane w egzomie guza zostaną ocenione, a liczba kopii somatycznych zostanie zidentyfikowana poprzez profilowanie liczby kopii danych NGS przy użyciu oprogramowania ngCGH, Contra i Nexus. Zidentyfikowane somatyczne mutacje punktowe zostaną zweryfikowane przy użyciu ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania. Badacze wybiorą kandydujące regiony chromosomalne na podstawie powtarzających się wariantów w guzach.

Charakterystyka kliniczna każdego guza przed usunięciem chirurgicznym zostanie oceniona poprzez ocenę seryjnych danych radiologicznych (MRI OUN) z całorocznego rocznego nadzoru każdego uczestnika i dodatkowych badań diagnostycznych:

1. Wielkość guza: oceniana na podstawie objętości guza (szerokość x długość x wysokość) x 0,5 (mm3)
2. Czas rozwoju guza: Oceniany na podstawie odstępu czasu od pierwszego pojawienia się guza na MRI do czasu operacji
3. Tempo wzrostu guza: oceniane na podstawie progresji radiologicznej, tj. zmiany objętości guza/odstępu czasowego między dwoma rezonansami magnetycznymi (miesiące)
4. Faza wzrostu guza: oceniana na podstawie fazy wzrostu guza przed operacją (stagnacja vs. faza wzrostu zdefiniowana przez zmianę objętości guza w odstępach czasowych między ostatnimi trzema badaniami MRI)
5. Związany rozwój torbieli i rozmiar torbieli przed operacją: Oceniono na podstawie objętości torbieli podczas ostatniego MRI przed operacją.

Te informacje kliniczne zostaną porównane z profilem genetycznym guza, aby ocenić wszelkie powiązania kliniczne z możliwymi czynnikami molekularnymi.