Drivere af hypoxi-induceret angiogenese i tumorudvikling

Baggrund Kræftcelleudvikling kræver en række erhvervede evner til at vokse og sprede sig: 1) selvforsyning med vækstsignaler, 2) ufølsomhed over for væksthæmningssignaler, 3) unddragelse af apoptose (programmeret celledød), 4) grænseløst replikativt potentiale, 5 ) vedvarende angiogenese og 6) vævsinvasion og metastase (Hanahan og Weinberg, 2000). Erhvervelsen af ​​disse evner er drevet af mutationer i centrale onkogener og tumorsuppressorgener, selvom de nøjagtige mekanismer endnu ikke er fuldt ud forstået. Især angiogenese er afgørende for en celles overlevelse, da dens fortsatte formering afhænger af ilt og næringsstoffer, der tilføres i vaskulaturen (Hanahan og Weinberg, 2000). Angiogenese kan initieres af mangel på ilt (hypoxi), og cellens iltfølende vej medierer et respons. Under normale forhold og i nærvær af oxygen, VHL-proteinet, medierer pVHL bindingen af ​​et ubiquitin-ligasekompleks til en gruppe af transkriptionsfaktorer kaldet Hypoxia inducible Factors (HIF'er) og dirigerer HIF-α-underenhederne til proteosomal nedbrydning. I normale celler med nok oxygen inhiberes HIF-a-induceret transkription af målgener. Under hypoxi er HIF-α ikke hydroxyleret og genkendes derfor ikke af VHL-proteinet. HIF'erne translokerer til kernen og inducerer transkription af adskillige gener, mange koder for angiogene faktorer, der stimulerer vækst af nye kar (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). Kræftvækst kræver store mængder ilt, og de fleste tumorceller er i en konstant tilstand af hypoxi.

Hvis der ikke er nogen funktionel pVHL i en celle, reagerer den, som om den har brug for ilt, da HIF'er vil stimulere angiogenese uanset iltniveauet. Derfor kan patienter med kimlinjemutationer i VHL-genet tjene som en model for hypoxi-induceret angiogenese. Patienter med kimlinje-VHL-mutationer har von Hippel-Lindaus sygdom (vHL) og er tilbøjelige til tumorudvikling på grund af denne mekanisme, hovedsageligt nyrecellekarcinom og hæmangioblastomer i centralnervesystemet (Maher et al., 2011). Selvom hæmangioblastomer er histologisk godartede tumorer, kan de have alvorlige konsekvenser. Den naturlige udvikling af hæmangioblastomer er karakteriseret ved uforudsigelige perioder med vækst og stagnation. Ofte udvikler de associerede cyster, der påvirker tilstødende nervevæv og forårsager massive symptomer, da selv små volumenændringer i hjernen kan forårsage alvorlig neurologisk skade eller endda død (Ammerman et al., 2006;Glasker et al., 2010;Wanebo et al. , 2003).

Mekanismerne bag vHL-associeret tumorgenese er komplekse og endnu ikke fuldt ud forstået. En nøglebegivenhed er tab af et funktionelt VHL-proteinprodukt som følge af inaktivering af begge alleler af VHL-genet i overensstemmelse med Knudsons to hit-hypotese (Vortmeyer et al., 2013). Det er imidlertid også klart, at selvom inaktivering af begge kopier af en persons VHL-gen er nødvendig, synes det ikke at være tilstrækkeligt til udvikling af hæmangioblastom (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004). Biallel VHL-inaktivering kan være til stede i form af multiple tumorprækursorer gennem prædisponerede væv, og de fleste udvikler sig aldrig til egentlige symptomfremkaldende tumorer (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004).

Nøglespørgsmålet til en bedre forståelse af, hvordan man bremser eller stopper tumorudvikling, er identifikation af, hvilke specifikke yderligere faktorer, der initierer eller fremmer tumorudvikling og -vækst. Tumorudvikling kan initieres i en enkelt celle, der unddrager sig normal kontrol af celledeling, men efterhånden som cellen deler sig og formerer sig, gennemgår dattercellerne en sekvens af flere genetiske hændelser i mange forskellige gener, der akkumuleres og giver tumoren vækstfordele ( Hanahan og Weinberg, 2011). En sådan sekvens fra benignt adenom til malignt karcinom er tidligere blevet kortlagt for udvikling af kolorektal cancer og har været af enorm betydning for vores nuværende forståelse af cancerudvikling (Fearon og Vogelstein, 1990). I tilfælde af hæmangioblastomer vil yderligere viden om eventuelle almindelige genetiske hændelser i andre gener end VHL-genet, der opstår i de tidlige stadier af hæmangioblastomprogression, hjælpe med at bestemme, hvilke specifikke gener der kan være drivkraften, dvs. fremme vækst og/eller cysteudvikling.

En gruppe har for nylig identificeret tab af HNF1B på kromosom 17q for at være en potentiel molekylær driver af hæmangioblastom tumorigenese ved hjælp af analyse af kopiantal variation i tumor DNA (Sun M et al., 2014). Andre grupper har fundet bevis for, at tab af ZAC1 på kromosom 6q spiller en stor rolle i både vHL-associeret og sporadisk CNS-hæmangioblastom tumorigenese (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). Mere systematiske tilgange til at undersøge hæmangioblastomas genetiske ændringer i et bredere perspektiv kunne imidlertid markant øge vores viden om sekvensen af ​​genetiske hændelser, der fører fra tumorprecursorer i tidlige stadier til fuldt udvoksede tumorer. Denne viden er af stor betydning, både i forhold til vores generelle forståelse af tumorigenese, men også i forhold til påvisning af tidlige nødvendige genetiske hændelser, der forekommer i alle hæmangioblastomer på tidlige stadier af tumorudvikling og kan være drivende for processen. Sådanne nødvendige hændelser i tumorprecursorcellerne kan bruges som biomarkører i vævsbiopsier eller tumorceller, der kommer ind i blodbanen for at bestemme, hvilke patienter der har størst risiko for aggressiv tumorvækst. Endelig vil ændringer i specifikke gener, der vides at være nøgletrin i at omdanne en tumorprækursor til klinisk signifikante tumorer, være oplagte kandidater til at målrette mod i udviklingen af ​​antitumorlægemidler.

For nylig er næste generations sekventeringsteknikker (NGS) blevet brugt med succes til at bestemme genetiske profiler og sekvens af specifikke genetiske hændelser i relation til individuel tumorprogression i flere andre tumortyper, herunder både sporadisk og vHL-associeret nyrecellekarcinom (RCC) (Fisher) et al., 2014;Gossage et al., 2015;Gundem et al., 2015;Kroigard et al., 2015). NGS gør det muligt at undersøge somatiske variationer i en tumors hele genom (dvs. variationer, der er udviklet specifikt i tumorens DNA og ikke i patientens kimlinje-DNA)(Nik-Zainal, 2014).

Undersøgelsens hypotese er, at forskellige CNS-hæmangioblastomer deler genetiske ændringer i specifikke gener, der fremmer eller initierer tumorudvikling fra VHL-deficiente celler, dvs. genetiske drivere til tumorudvikling. Forskerne antager yderligere, at nogle af disse genetiske ændringer repræsenterer trin i sekvensen af ​​hæmangioblastomprogression. Ved at sammenligne genetiske ændringer i tumorer på forskellige udviklingsstadier, med forskellige vækstmønstre og med og uden tilhørende cysteudvikling, forsøger investigatorshope at belyse de mulige udviklingsrelaterede genetiske ændringer, der forekommer i denne sekvens. Baseret på hvor ofte genetiske varianter deles af de separate tumorer, kan det estimeres, hvilke gener der sandsynligvis er involveret på forskellige stadier i hæmangioblastom udvikling. I dette pilotprojekt planlægger efterforskerne at analysere separate tumorer, der stammer fra den samme patient, såvel som tumorer, der stammer fra forskellige patienter for at evaluere intra- og interpatientforskelle.

Fund af kandidat-genetiske drivere i dette projekt vil efterfølgende blive bekræftet i en større serie af både vHL-associerede såvel som sporadiske CNS-hæmangioblastomer, som vil blive indsamlet i en løbende proces. Efterforskerne planlægger også at sammenligne resultaterne med nylige fund af kandidat genetiske drivere i nyrecellekarcinomer i et igangværende projekt udført af nogle af vores samarbejdspartnere.

Materiale Efterforskerne har identificeret danske vHL-patienter gennem flere nationale sundhedsregistre og bedt patienter over 18 år om at deltage. Samtykke deltagere blev interviewet om deres sygehistorie og oplysningerne verificeret gennem lægejournaler.

Deltagernes VHL-kimlinjemutationer identificeres ved hjælp af DNA ekstraheret fra perifere blodprøver, og til dette pilotprojekt vil kun dem med en identificerbar patogen VHL-kimlinjemutation fundet i DNA fra perifere lymfocytter ved hjælp af direkte sekventering af exoner og exon-intron-grænser og MLPA. være med.

I undersøgelsen vil vævsprøver fra alle opnåelige CNS-hæmangioblastomer, der er blevet kirurgisk fjernet som en del af en deltagers behandling, blive indsamlet, enten som paraffinindlejret væv, som frisk frosset væv eller som frisk væv konserveret i RNAlater.

Til det foreslåede projekt vil mindst to opnåelige CNS-hæmangioblastomer fra hver deltager blive udvalgt NGS-analyse. Efterforskerne forventer at kunne inkludere DNA fra mindst 19 tumorprøver, herunder DNA ekstraheret fra både paraffinindlejret tumorvæv, friskfrosset og væv suspenderet i RNAlater.

Metoder DNA fra hver deltager isoleres fra tumorvæv og fra normalt væv (dvs. perifert blod) ved brug af standardprotokoller. Det paraffinindlejrede væv kan indeholde både tumorvæv og normalt omgivende væv. For at sikre, at DNA'et fra vævet repræsenterer tumor-DNA'et, vil efterforskerne først evaluere HE-farvede snit og sikre, at > 85 % af vævssnittet indeholder tumor.

Exomberigelse af både tumor- og normalvævs-DNA vil blive udført ved hjælp af et Niblegen 64Mb-panel, der inkluderer alle kendte gener samt miRNA- og lincRNA-gener. Det berigede DNA vil blive sekventeret ved hjælp af Illumina Hiseq1500-platformen med parret endesekventering på 2X100 baser og en gennemsnitlig dækningshastighed på 75-100 x. Resultaterne fra hver tumor-DNA-prøve vil blive sammenlignet med DNA fra patientens normale væv for at skelne kimlinievariationer fra tumorspecifikke genetiske ændringer og derved opnå profilen af ​​somatiske genetiske ændringer, der hører til tumor-DNA'et.

Somatiske mutationer vil blive identificeret ved hjælp af somatisk variant-opkaldssoftware som VarScan, Mutect, EBCall eller Virmid. Identificerede somatiske varianter lokaliseret til tumorens exome vil blive vurderet, og somatiske kopiantalhændelser vil blive identificeret gennem kopinummerprofilering af NGS-dataene ved hjælp af ngCGH, Contra og Nexus software. Identificerede somatiske punktmutationer vil blive valideret ved hjælp af målrettet dyb sekventering. Efterforskerne vil udvælge kromosomale kandidatregioner baseret på tilbagevendende varianter på tværs af tumorer.

Hver tumors kliniske karakteristika forud for kirurgisk fjernelse vil blive vurderet gennem evaluering af serielle radiologiske data (MRI'er af CNS) fra hver deltagers årlange årlige overvågning og yderligere diagnostiske undersøgelser:

1. Tumorstørrelse: Vurderet ved tumorvolumen (bredde x længde x højde) x 0,5 (mm3)
2. Tumorudviklingstid: Vurderet efter tidsinterval fra tumoren var først synlig på MRI til tidspunktet for operationen
3. Tumorvæksthastighed: Vurderet ved radiologisk progression, dvs. ændring i tumorvolumen/tidsinterval mellem to MRI'er (måneder)
4. Tumorvækstfase: Vurderet ved hvilken vækstfase tumoren befandt sig i før operationen (stagnerende vs. vækstfase defineret ved ændring i tumorvolumen i tidsintervallerne mellem de seneste tre MRI'er)
5. Associeret cysteudvikling og cystestørrelse før operation: Vurderet ved cystevolumen ved sidste MR før operation.

Denne kliniske information vil blive sammenlignet med tumorens genetiske profil for at vurdere eventuelle kliniske associationer til mulige molekylære drivere.