腫瘍発生における低酸素誘導血管新生のドライバー

背景 がん細胞の発生には、増殖および拡散するための一連の獲得能力が必要です。1) 増殖シグナルの自給自足、2) 増殖阻害シグナルに対する非感受性、3) アポトーシスの回避 (プログラムされた細胞死)、4) 無限の複製可能性、5 ) 持続的な血管新生、および 6) 組織浸潤および転移 (Hanahan and Weinberg, 2000)。 正確なメカニズムはまだ完全には理解されていませんが、これらの能力の獲得は、主要な癌遺伝子および癌抑制遺伝子の変異によって促進されます。 特に、血管新生は細胞の生存にとって重要です。継続的な増殖は、血管系に供給される酸素と栄養素に依存するからです (Hanahan and Weinberg, 2000)。 血管新生は酸素の欠乏 (低酸素症) によって開始される可能性があり、細胞の酸素感知経路が応答を仲介します。 通常の条件下で酸素が存在する場合、VHL タンパク質である pVHL は、低酸素誘導因子 (HIF) と呼ばれる転写因子のグループへのユビキチンリガーゼ複合体の結合を仲介し、HIF-α サブユニットをプロテオソーム分解に誘導します。 したがって、酸素が十分にある正常な細胞では、HIF-αによって誘導される標的遺伝子の転写が阻害されます。 低酸素状態の間、HIF-α はヒドロキシル化されないため、VHL タンパク質によって認識されません。 HIF は核に移行し、多数の遺伝子の転写を誘導します。その多くは、新しい血管の成長を刺激する血管新生因子をコードしています (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010)。 がんの増殖には大量の酸素が必要であり、ほとんどの腫瘍細胞は常に低酸素状態にあります。

細胞内に機能的な pVHL がない場合、HIF は酸素レベルに関係なく血管新生を刺激するため、酸素が必要であるかのように反応します。 したがって、VHL 遺伝子に生殖細胞変異を有する患者は、低酸素誘導血管新生のモデルとして役立ちます。 生殖細胞系列の VHL 変異を有する患者は、フォン ヒッペル-リンダウス病 (vHL) を患っており、このメカニズムにより、主に腎細胞癌および中枢神経系 (CNS) 血管芽腫の腫瘍が発生する傾向があります (Maher et al., 2011)。 血管芽腫は組織学的に良性の腫瘍ですが、深刻な結果をもたらす可能性があります。 血管芽腫の自然な発生は、予測不可能な成長と停滞の期間によって特徴付けられます。 多くの場合、隣接する神経組織に影響を及ぼし、大規模な症状を引き起こす関連する嚢胞を発症します。脳内のわずかな体積の変化でさえ、重度の神経学的損傷または死さえも引き起こす可能性があるためです(Ammerman et al., 2006; Glasker et al., 2010; Wanebo et al. 、2003）。

vHL 関連の腫瘍形成の背後にあるメカニズムは複雑であり、まだ完全には理解されていません。 重要なイベントは、Knudson の 2 ヒット仮説 (Vortmeyer et al., 2013) に従って、VHL 遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された結果、機能的な VHL タンパク質産物が失われることです。 しかし、人の VHL 遺伝子の両方のコピーの不活性化が必要であるにもかかわらず、血管芽腫の発生には十分ではないようであることも明らかです (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004)。 両アレル性 VHL の不活性化は、素因のある組織全体に複数の腫瘍前駆体の形で存在する可能性があり、実際に症状を引き起こす腫瘍に発展することはほとんどありません (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004)。

腫瘍の発生を遅らせたり止めたりする方法をよりよく理解するための重要な問題は、どの特定の追加因子が腫瘍の発生と成長を開始または促進するかを特定することです。 腫瘍の発生は、細胞分裂の正常な制御を回避する単一の細胞で開始される可能性がありますが、細胞が分裂して増殖するにつれて、娘細胞は、蓄積して腫瘍に成長の利点を提供する多くの異なる遺伝子で一連の複数の遺伝的イベントを経ます(ハナハンとワインバーグ、2011)。 良性腺腫から悪性癌腫へのこのような順序は、以前に結腸直腸癌の発生についてマッピングされており、現在の癌発生の理解にとって非常に重要です (Fearon and Vogelstein, 1990)。 血管芽細胞腫の場合、血管芽細胞腫の進行の初期段階で発生する VHL 遺伝子以外の遺伝子で一般的な遺伝的事象に関するさらなる知識は、どの特定の遺伝子が駆動している可能性があるか、つまり成長および/または嚢胞の発生を促進している可能性があるかを判断するのに役立ちます。

あるグループは最近、腫瘍 DNA のコピー数変動の分析を使用して、染色体 17q 上の HNF1B の喪失が血管芽腫の腫瘍形成の潜在的な分子ドライバーであることを特定しました (Sun M et al., 2014)。 他のグループは、染色体 6q 上の ZAC1 の喪失が、vHL 関連および散発性 CNS 血管芽腫の腫瘍形成において主要な役割を果たしているという証拠を発見しました (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010)。 しかし、血管芽腫の遺伝的変化をより広い視野で調査するより体系的なアプローチにより、初期段階の腫瘍前駆体から完全に成長した腫瘍に至る一連の遺伝的事象に関する知識が著しく増加する可能性があります。 この知識は、腫瘍形成の一般的な理解に関連するだけでなく、腫瘍発生の初期段階ですべての血管芽細胞腫に発生し、プロセスを推進している可能性のある初期の必要な遺伝的イベントの検出に関連して、非常に重要です。 腫瘍前駆細胞におけるこのような必要なイベントは、どの患者が攻撃的な腫瘍増殖のリスクが最も高いかを決定するために、血流に入る組織生検または腫瘍細胞のバイオマーカーとして使用される可能性があります。 最後に、腫瘍前駆体を臨床的に重要な腫瘍に変える重要なステップであることが知られている特定の遺伝子の変化は、抗腫瘍薬の開発で標的とする明らかな候補となるでしょう。

最近、次世代シーケンシング (NGS) 技術を使用して、散発性および vHL 関連の腎細胞癌 (RCC) (Fisher et al., 2014; Gossage et al., 2015; Gundem et al., 2015; Kroigard et al., 2015)。 NGS は、腫瘍のゲノム全体の体細胞変異を調べることを可能にします (つまり、 患者の生殖細胞系 DNA ではなく、腫瘍の DNA に特異的に発生した変異）（Nik-Zainal、2014）。

研究者らは、異なる CNS 血管芽腫は、VHL 欠損細胞からの腫瘍発生を促進または開始する特定の遺伝子、つまり腫瘍発生の遺伝的ドライバーの遺伝的変化を共有していると仮定しています。 研究者らはさらに、これらの遺伝子変化のいくつかは、血管芽腫の進行の順序を表しているという仮説を立てています。 開発のさまざまな段階で、さまざまな成長パターンを持ち、関連する嚢胞の発生がある場合とない場合の腫瘍の遺伝子変化を比較することにより、研究者は、このシーケンスで発生する可能性のある発生関連の遺伝子変化を解明しようとしています。 個々の腫瘍で遺伝子変異が共有される頻度に基づいて、どの遺伝子が血管芽腫発生のさまざまな段階に関与している可能性が高いかを推定できます。 このパイロットプロジェクトでは、研究者は、同じ患者に由来する別々の腫瘍と異なる患者に由来する腫瘍を分析して、患者内および患者間の違いを評価することを計画しています。

このプロジェクトにおける候補遺伝子ドライバーの発見は、その後、vHL 関連および散発性 CNS 血管芽腫の両方のより大きなシリーズで確認され、進行中のプロセスで収集されます。 また、研究者らは、一部の共同研究者によって実施されている進行中のプロジェクトで、腎細胞がんの候補遺伝子ドライバーの最近の発見と調査結果を比較することを計画しています。

材料 研究者は、複数の国民健康登録簿を通じてデンマークの vHL 患者を特定し、18 歳以上の患者に参加を求めました。 同意した参加者は、病歴と医療記録を通じて検証された情報についてインタビューを受けました。

参加者の VHL 生殖細胞変異は、末梢血サンプルから抽出された DNA を使用して特定されます。このパイロット プロジェクトでは、エクソンおよびエクソン - イントロン境界の直接配列決定と MLPA を使用して、末梢リンパ球の DNA に特定可能な病原性 VHL 生殖細胞変異が見つかったもののみが対象となります。含まれます。

この研究では、参加者の治療の一環として外科的に切除された入手可能なすべての CNS 血管芽腫からの組織サンプルが、パラフィン包埋組織、新鮮凍結組織、または RNAlater に保存された新鮮組織として収集されます。

提案されたプロジェクトでは、各参加者から少なくとも 2 つの達成可能な CNS 血管芽腫が選択され、NGS 分析が行われます。 研究者らは、パラフィン包埋腫瘍組織、新鮮凍結および RNAlater に懸濁した組織の両方から抽出された DNA を含む、少なくとも 19 の腫瘍サンプルからの DNA を含めることができると予想しています。

方法 各参加者の DNA は、腫瘍組織と正常組織から分離されます (つまり、 末梢血) 標準プロトコルを使用して。 パラフィン包埋組織には、腫瘍組織と周囲の正常組織の両方が含まれる場合があります。 組織からの DNA が腫瘍 DNA を表していることを確認するために、研究者はまず HE 染色切片を評価し、組織切片の > 85% に腫瘍が含まれていることを確認します。

腫瘍組織と正常組織の両方の DNA のエクソーム濃縮は、すべての既知の遺伝子と miRNA および lincRNA 遺伝子を含む Niblegen 64Mb パネルを使用して実行されます。 濃縮された DNA は、イルミナ Hiseq1500 プラットフォームを使用して、2X100 塩基のペアエンド シーケンスと 75 ～ 100 x の平均カバレッジ率でシーケンスされます。 各腫瘍 DNA サンプルからの結果は、患者の正常組織の DNA と比較され、生殖細胞変異と腫瘍特異的遺伝子変化を区別し、それによって腫瘍 DNA に属する体細胞遺伝子変化のプロファイルを取得します。

体細胞変異は、VarScan、Mutect、EBCall、または Virmid などの体細胞バリアント コーラー ソフトウェアを使用して識別されます。 腫瘍のエクソームに位置する特定された体細胞バリアントが評価され、体細胞コピー数イベントは、ngCGH、Contra、および Nexus ソフトウェアを使用した NGS データのコピー数プロファイリングを通じて特定されます。 識別された体細胞の点変異は、ターゲットを絞ったディープ シーケンスを使用して検証されます。 研究者は、腫瘍全体で再発する変異に基づいて染色体候補領域を選択します。

外科的除去前の各腫瘍の臨床的特徴は、各参加者の年間の年次監視および追加の診断検査からの一連の放射線データ（CNSのMRI）の評価を通じて評価されます。

1. 腫瘍の大きさ：腫瘍体積（幅×長さ×高さ）×0.5（mm3）で評価
2. 腫瘍発生時間：MRIで腫瘍が最初に見えてから手術までの時間間隔で評価
3. 腫瘍増殖率: 放射線学的進行、すなわち腫瘍体積の変化/2回のMRI間の時間間隔(月)によって評価
4. 腫瘍増殖期：手術前の腫瘍の増殖期によって評価されます（最新の 3 回の MRI 間の時間間隔における腫瘍体積の変化によって定義される停滞期と増殖期）。
5. 関連する嚢胞の発生と手術前の嚢胞のサイズ: 手術前の最後の MRI での嚢胞の体積によって評価されます。

この臨床情報は、腫瘍の遺伝的プロファイルと比較され、可能性のある分子ドライバーとの臨床的関連性を評価します。