Impulsionadores da angiogênese induzida por hipóxia no desenvolvimento de tumores

Antecedentes O desenvolvimento das células cancerígenas requer uma série de capacidades adquiridas para crescer e se espalhar: 1) auto-suficiência em sinais de crescimento, 2) insensibilidade aos sinais de inibição do crescimento, 3) evasão da apoptose (morte celular programada), 4) potencial replicativo ilimitado, 5 ) angiogênese sustentada e 6) invasão tecidual e metástase (Hanahan e Weinberg, 2000). A aquisição dessas capacidades é impulsionada por mutações nos principais oncogenes e genes supressores de tumores, embora os mecanismos exatos ainda não sejam totalmente compreendidos. Especialmente a angiogênese é crucial para a sobrevivência de uma célula, pois sua multiplicação contínua depende do oxigênio e dos nutrientes fornecidos na vasculatura (Hanahan e Weinberg, 2000). A angiogênese pode ser iniciada pela falta de oxigênio (hipóxia), e a via de detecção de oxigênio da célula medeia uma resposta. Em condições normais e na presença de oxigênio, a proteína VHL, pVHL medeia a ligação de um complexo ubiquitina ligase a um grupo de fatores de transcrição denominados Fatores Induzíveis por Hipóxia (HIFs) e direciona as subunidades HIF-α para a degradação proteossomal. Assim, em células normais com oxigênio suficiente, a transcrição de genes alvo induzida por HIF-α é inibida. Durante a hipóxia, o HIF-α não é hidroxilado e, portanto, não é reconhecido pela proteína VHL. Os HIFs se translocam para o núcleo e induzem a transcrição de numerosos genes, muitos codificando fatores angiogênicos que estimulam o crescimento de novos vasos (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). O crescimento do câncer requer grandes quantidades de oxigênio e a maioria das células tumorais está em constante estado de hipóxia.

Se não houver pVHL funcional em uma célula, ela reage como se precisasse de oxigênio, pois os HIFs estimularão a angiogênese independentemente dos níveis de oxigênio. Portanto, pacientes com mutações germinativas no gene VHL podem servir como um modelo de angiogênese induzida por hipóxia. Pacientes com mutações germinativas VHL têm doença de von Hippel-Lindaus (vHL) e são propensos ao desenvolvimento de tumores devido a esse mecanismo, principalmente carcinoma de células renais e hemangioblastomas do sistema nervoso central (SNC) (Maher et al., 2011). Embora os hemangioblastomas sejam tumores histologicamente benignos, eles podem ter consequências graves. O desenvolvimento natural dos hemangioblastomas é caracterizado por períodos imprevisíveis de crescimento e estagnação. Frequentemente, desenvolvem cistos associados que afetam o tecido nervoso adjacente e causam sintomas maciços, pois mesmo pequenas alterações de volume no cérebro podem causar danos neurológicos graves ou até a morte (Ammerman et al., 2006;Glasker et al., 2010;Wanebo et al. , 2003).

Os mecanismos por trás da tumorgênese associada à vHL são complexos e ainda não totalmente compreendidos. Um evento chave é a perda de um produto de proteína VHL funcional como resultado da inativação de ambos os alelos do gene VHL de acordo com a hipótese de dois sucessos de Knudson (Vortmeyer et al., 2013). No entanto, também está claro que, embora a inativação de ambas as cópias do gene VHL de uma pessoa seja necessária, ela não parece ser suficiente para o desenvolvimento do hemangioblastoma(Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004). A inativação bialélica de VHL pode estar presente na forma de múltiplos precursores tumorais em tecidos predispostos, e a maioria nunca se desenvolve em tumores realmente causadores de sintomas (Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004).

A questão-chave para uma melhor compreensão de como retardar ou interromper o desenvolvimento do tumor é a identificação de quais fatores adicionais específicos iniciam ou promovem o desenvolvimento e o crescimento do tumor. O desenvolvimento do tumor pode ser iniciado em uma única célula que foge do controle normal da divisão celular, mas conforme a célula se divide e se multiplica, as células-filhas passam por uma sequência de múltiplos eventos genéticos em muitos genes diferentes que se acumulam e fornecem ao tumor vantagens de crescimento ( Hanahan e Weinberg, 2011). Essa sequência de adenoma benigno para carcinoma maligno foi previamente mapeada para o desenvolvimento do câncer colorretal e tem sido de imensa importância para nossa compreensão atual do desenvolvimento do câncer (Fearon e Vogelstein, 1990). No caso dos hemangioblastomas, o conhecimento adicional sobre quaisquer eventos genéticos comuns em outros genes além do gene VHL que ocorrem nos estágios iniciais da progressão do hemangioblastoma ajudará a determinar quais genes específicos podem estar conduzindo, ou seja, promovendo o crescimento e/ou o desenvolvimento do cisto.

Um grupo identificou recentemente a perda de HNF1B no cromossomo 17q como um potencial condutor molecular da tumorigênese do hemangioblastoma usando a análise da variação do número de cópias no DNA do tumor (Sun M et al., 2014). Outros grupos encontraram evidências de que a perda de ZAC1 no cromossomo 6q desempenha um papel importante na tumorigênese esporádica e associada ao vHL do hemangioblastoma do SNC (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). No entanto, abordagens mais sistemáticas que investigam as alterações genéticas dos hemangioblastomas em uma perspectiva mais ampla podem aumentar significativamente nosso conhecimento da sequência de eventos genéticos que levam dos precursores do tumor em estágio inicial aos tumores totalmente desenvolvidos. Este conhecimento é de grande importância, tanto em relação à nossa compreensão geral da tumorigênese, mas também em relação à detecção de eventos genéticos precoces necessários que ocorrem em todos os hemangioblastomas nos estágios iniciais do desenvolvimento do tumor e podem estar conduzindo o processo. Esses eventos necessários nas células precursoras do tumor podem ser usados ​​como biomarcadores em biópsias de tecidos ou células tumorais que chegam à corrente sanguínea para determinar quais pacientes correm maior risco de crescimento tumoral agressivo. Finalmente, alterações em genes específicos que são conhecidas como etapas-chave na transformação de precursores de tumor em tumores clinicamente significativos seriam candidatos óbvios para o desenvolvimento de drogas antitumorais.

Recentemente, as técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) foram usadas com sucesso para determinar perfis genéticos e sequência de eventos genéticos específicos em relação à progressão tumoral individual em vários outros tipos de tumor, incluindo carcinoma de células renais (RCC) esporádico e associado a vHL (Fisher et al., 2014;Gossage et al., 2015;Gundem et al., 2015;Kroigard et al., 2015). NGS torna possível examinar variações somáticas em todo o genoma de um tumor (ou seja, variações que se desenvolveram especificamente no DNA do tumor e não no DNA germinativo do paciente)(Nik-Zainal, 2014).

A hipótese dos investigadores do estudo é que diferentes hemangioblastomas do SNC compartilham alterações genéticas em genes específicos que promovem ou iniciam o desenvolvimento do tumor a partir de células deficientes em VHL, ou seja, condutores genéticos do desenvolvimento do tumor. Os investigadores levantaram a hipótese de que algumas dessas alterações genéticas representam etapas na sequência da progressão do hemangioblastoma. Ao comparar alterações genéticas em tumores em diferentes estágios de desenvolvimento, com diferentes padrões de crescimento, com e sem desenvolvimento de cisto associado, o pesquisador espera elucidar as possíveis alterações genéticas relacionadas ao desenvolvimento que ocorrem nessa sequência. Com base na frequência com que as variantes genéticas são compartilhadas pelos tumores separados, pode-se estimar quais genes provavelmente estão envolvidos em diferentes estágios do desenvolvimento do hemangioblastoma. Neste projeto piloto, os pesquisadores planejam analisar tumores separados originários do mesmo paciente, bem como tumores originários de diferentes pacientes para avaliar as diferenças intra e interpacientes.

Os achados de drivers genéticos candidatos neste projeto serão subsequentemente confirmados em uma série maior de hemangioblastomas do SNC associados a vHL e esporádicos, que serão coletados em um processo contínuo. Além disso, os pesquisadores planejam comparar as descobertas com descobertas recentes de condutores genéticos candidatos em carcinomas de células renais em um projeto em andamento realizado por alguns de nossos colaboradores.

Material Os investigadores identificaram pacientes dinamarqueses vHL por meio de vários registros nacionais de saúde e pediram a participação de pacientes com mais de 18 anos. Os participantes que consentiram foram entrevistados sobre seus históricos médicos e as informações verificadas por meio de prontuários médicos.

As mutações germinativas VHL dos participantes são identificadas usando DNA extraído de amostras de sangue periférico e, para este projeto piloto, apenas aquelas com uma mutação patogênica identificável da linha germinativa VHL encontrada no DNA de linfócitos periféricos usando sequenciamento direto de éxons e fronteiras éxon-íntron e MLPA, ser incluido.

No estudo, amostras de tecido de todos os hemangioblastomas do SNC obtidos que foram removidos cirurgicamente como parte do tratamento de um participante serão coletadas, seja como tecido embebido em parafina, como tecido fresco congelado ou como tecido fresco conservado em RNAlater.

Para o projeto proposto, pelo menos dois hemangioblastomas do SNC atingíveis de cada participante serão selecionados para análise NGS. Os investigadores esperam poder incluir DNA de pelo menos 19 amostras de tumor, incluindo DNA extraído de tecido tumoral embebido em parafina, congelado fresco e tecido suspenso em RNAlater.

Métodos O DNA de cada participante é isolado do tecido tumoral e do tecido normal (i.e. sangue periférico) usando protocolos padrão. O tecido embebido em parafina pode conter tanto tecido tumoral quanto tecido circundante normal. Para garantir que o DNA do tecido representa o DNA do tumor, os investigadores avaliarão primeiro as seções coradas com HE e garantirão que > 85% da seção de tecido contenha tumor.

O enriquecimento do exoma do DNA tumoral e do tecido normal será realizado usando um painel Niblegen 64Mb incluindo todos os genes conhecidos, bem como os genes miRNA e lincRNA. O DNA enriquecido será sequenciado utilizando a plataforma Illumina Hiseq1500 com sequenciamento pareado de 2X100 bases e taxa média de cobertura de 75-100x. Os resultados de cada amostra de DNA tumoral serão comparados com o DNA do tecido normal do paciente para distinguir variações germinativas de alterações genéticas específicas do tumor e, assim, obter o perfil de alterações genéticas somáticas pertencentes ao DNA tumoral.

Mutações somáticas serão identificadas usando software chamador de variante somática como VarScan, Mutect, EBCall ou Virmid. As variantes somáticas identificadas localizadas no exoma do tumor serão avaliadas e os eventos do número de cópias somáticas serão identificados por meio do perfil do número de cópias dos dados NGS usando os softwares ngCGH, Contra e Nexus. As mutações pontuais somáticas identificadas serão validadas usando sequenciamento profundo direcionado. Os investigadores selecionarão regiões candidatas cromossômicas com base em variantes recorrentes nos tumores.

As características clínicas de cada tumor antes da remoção cirúrgica serão avaliadas por meio da avaliação de dados radiológicos seriados (MRIs do SNC) da vigilância anual de um ano de cada participante e exames diagnósticos adicionais:

1. Tamanho do tumor: avaliado pelo volume do tumor (largura x comprimento x altura) x 0,5 (mm3)
2. Tempo de desenvolvimento do tumor: avaliado pelo intervalo de tempo desde que o tumor foi visível pela primeira vez na ressonância magnética até o momento da cirurgia
3. Taxa de crescimento do tumor: avaliada pela progressão radiológica, ou seja, alteração no volume do tumor/intervalo de tempo entre duas ressonâncias magnéticas (meses)
4. Fase de crescimento do tumor: avaliado por qual fase de crescimento estava o tumor antes da cirurgia (estagnação vs. fase de crescimento definida pela alteração no volume do tumor nos intervalos de tempo entre as três últimas ressonâncias magnéticas)
5. Desenvolvimento de cisto associado e tamanho do cisto antes da cirurgia: Avaliado pelo volume do cisto na última ressonância magnética antes da cirurgia.

Esta informação clínica será comparada com o perfil genético do tumor para avaliar quaisquer associações clínicas a possíveis drivers moleculares.