종양 발달에서 저산소증 유발 혈관 신생의 동인

배경 암 세포 발달은 성장 및 확산을 위해 일련의 획득된 능력을 필요로 합니다: 1) 성장 신호의 자급 자족, 2) 성장 억제 신호에 대한 무감각, 3) 세포사멸(프로그램된 세포 사멸)의 회피, 4) 무한한 복제 가능성, 5 ) 지속적인 혈관신생 및 6) 조직 침범 및 전이(Hanahan and Weinberg, 2000). 이러한 능력의 획득은 정확한 메커니즘이 아직 완전히 이해되지는 않았지만 주요 발암 유전자 및 종양 억제 유전자의 돌연변이에 의해 주도됩니다. 특히 혈관신생은 세포의 지속적인 증식이 맥관 구조에 공급되는 산소와 영양분에 의존하기 때문에 세포의 생존에 매우 중요합니다(Hanahan and Weinberg, 2000). 혈관신생은 산소 부족(저산소증)에 의해 시작될 수 있으며 세포의 산소 감지 경로가 반응을 중재합니다. 정상적인 조건과 산소의 존재 하에서 VHL 단백질인 pVHL은 ubiquitin ligase 복합체와 HIF(Hypoxia inducible Factors)라는 전사 인자 그룹의 결합을 매개하고 HIF-α 서브유닛을 프로테오솜 분해로 유도합니다. 따라서 충분한 산소가 있는 정상 세포에서는 HIF-α에 의해 유도된 표적 유전자의 전사가 억제됩니다. 저산소증 동안 HIF-α는 수산화되지 않으므로 VHL 단백질에 의해 인식되지 않습니다. HIF는 핵으로 전이되어 새로운 혈관 성장을 자극하는 혈관신생 인자를 암호화하는 수많은 유전자의 전사를 유도합니다(Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). 암 성장에는 막대한 양의 산소가 필요하며 대부분의 종양 세포는 일정한 저산소 상태에 있습니다.

세포에 기능적 pVHL이 없으면 HIF가 산소 수준에 관계없이 혈관신생을 자극하기 때문에 마치 산소가 필요한 것처럼 반응합니다. 따라서 VHL 유전자에 생식계열 돌연변이가 있는 환자는 저산소증 유발 혈관신생의 모델이 될 수 있습니다. 생식계열 VHL 돌연변이가 있는 환자는 von Hippel-Lindaus 질병(vHL)을 가지고 있으며 이 메커니즘으로 인해 주로 신장 세포 암종 및 중추신경계(CNS) 혈관모세포종으로 인해 종양이 발생하기 쉽습니다(Maher et al., 2011). 혈관모세포종은 조직학적으로 양성 종양이지만 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 혈관모세포종의 자연 발생은 예측할 수 없는 성장 및 침체 기간을 특징으로 합니다. 종종 그들은 인접한 신경 조직에 영향을 미치고 뇌의 작은 부피 변화가 심각한 신경학적 손상 또는 심지어 사망을 유발할 수 있기 때문에 대규모 증상을 유발하는 관련 낭종을 개발합니다(Ammerman et al., 2006; Glasker et al., 2010; Wanebo et al. , 2003).

vHL 관련 종양 발생의 메커니즘은 복잡하고 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 핵심 사건은 Knudson의 두 적중 가설(Vortmeyer et al., 2013)에 따라 VHL 유전자의 두 대립 유전자 모두의 불활성화 결과로 기능적인 VHL 단백질 산물의 손실입니다. 그러나 사람의 VHL 유전자의 두 복사본 모두의 불활성화가 필요하지만 혈관모세포종 발생에 충분하지 않은 것으로 보인다(Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004). 이중대립유전자 VHL 불활성화는 소인이 있는 조직 전체에 걸쳐 여러 종양 전구체의 형태로 존재할 수 있으며 대부분은 실제 증상 유발 종양으로 발전하지 않습니다(Vortmeyer et al., 2013; Vortmeyer et al., 2006; Vortmeyer et al., 2004).

종양 발달을 늦추거나 멈추는 방법을 더 잘 이해하기 위한 핵심 질문은 어떤 특정 추가 요인이 종양 발달 및 성장을 시작하거나 촉진하는지 식별하는 것입니다. 종양 발달은 세포 분열의 정상적인 제어를 피하는 단일 세포에서 시작될 수 있지만 세포가 분열하고 증식함에 따라 딸 세포는 종양에 성장 이점을 축적하고 제공하는 많은 다른 유전자에서 일련의 여러 유전적 사건을 겪습니다. 하나한과 와인버그, 2011). 양성 선종에서 악성 암종으로의 이러한 순서는 이전에 결장직장암 발달에 대해 매핑되었으며 현재 암 발달에 대한 우리의 이해에 매우 중요합니다(Fearon and Vogelstein, 1990). 혈관모세포종의 경우, 혈관모세포종 진행의 초기 단계에서 발생하는 VHL 유전자 이외의 다른 유전자의 일반적인 유전적 사건에 대한 추가 지식은 어떤 특정 유전자가 성장 및/또는 낭종 발달을 촉진하는지 결정하는 데 도움이 될 것입니다.

한 그룹은 최근 종양 DNA의 복제 수 변이 분석을 사용하여 17q 염색체에서 HNF1B의 손실이 혈관모세포종 종양 형성의 잠재적인 분자 동인임을 확인했습니다(Sun M et al., 2014). 다른 그룹은 염색체 6q에서 ZAC1의 소실이 vHL 관련 및 산발성 CNS 혈관모세포종 종양 형성 모두에서 중요한 역할을 한다는 증거를 발견했습니다(Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). 그러나 더 넓은 관점에서 혈관모세포종의 유전적 변이를 조사하는 보다 체계적인 접근법은 초기 단계의 종양 전구체에서 완전히 성장한 종양으로 이어지는 유전적 사건의 순서에 대한 우리의 지식을 현저하게 증가시킬 수 있습니다. 이 지식은 종양 형성에 대한 우리의 일반적인 이해와 관련하여 매우 중요하며, 또한 종양 발달의 초기 단계에서 모든 혈관모세포종에서 발생하고 그 과정을 주도할 수 있는 초기 필수 유전학 사건의 탐지와 관련하여 매우 중요합니다. 종양 전구체 세포에서 이러한 필수 이벤트는 공격적인 종양 성장의 위험이 가장 큰 환자를 결정하기 위해 조직 생검 또는 혈류로 들어가는 종양 세포에서 바이오마커로 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 종양 전구체를 임상적으로 중요한 종양으로 바꾸는 핵심 단계로 알려진 특정 유전자의 변화는 항종양 약물 개발에서 목표로 삼을 명백한 후보가 될 것입니다.

최근 차세대 시퀀싱(NGS) 기술은 산발성 및 vHL 관련 신장 세포 암종(RCC)을 포함한 여러 다른 종양 유형에서 개별 종양 진행과 관련하여 특정 유전적 사건의 유전적 프로필 및 시퀀스를 결정하는 데 성공적으로 사용되었습니다(Fisher et al., 2014; Gossage et al., 2015; Gundem et al., 2015; Kroigard et al., 2015). NGS는 종양의 전체 게놈(즉, 환자의 생식계열 DNA가 아닌 종양의 DNA에서 특이적으로 발달한 변이)(Nik-Zainal, 2014).

연구 조사관은 서로 다른 CNS 혈관모세포종이 VHL-결핍 세포로부터 종양 발달을 촉진하거나 개시하는 특정 유전자, 즉 종양 발달의 유전적 동인에서 유전적 변경을 공유한다는 가설을 세웠습니다. 연구자들은 이러한 유전적 변화 중 일부가 혈관모세포종 진행 순서의 단계를 나타낸다는 가설을 더 세웠습니다. 다양한 발달 단계에서 다양한 성장 패턴과 관련된 낭종 발달 유무에 따른 종양의 유전적 변이를 비교함으로써 연구자는 이 순서에서 발생하는 가능한 발달 관련 유전적 변이를 밝히기 위해 노력합니다. 개별 종양이 유전적 변이를 얼마나 자주 공유하는지에 따라 혈관모세포종 발달의 여러 단계에서 관련될 가능성이 있는 유전자를 추정할 수 있습니다. 이 파일럿 프로젝트에서 조사관은 환자 내 및 환자 간 차이점을 평가하기 위해 동일한 환자에서 유래한 개별 종양과 다른 환자에서 유래한 종양을 분석할 계획입니다.

이 프로젝트에서 후보 유전자 동인의 발견은 계속 진행 중인 과정에서 수집될 산발성 CNS 혈관모세포종뿐만 아니라 vHL과 관련된 더 큰 시리즈에서 확인될 것입니다. 또한 조사관은 연구 결과를 일부 공동 작업자가 수행하는 진행 중인 프로젝트에서 신장 세포 암종의 후보 유전자 동인에 대한 최근 발견과 비교할 계획입니다.

자료 조사관은 여러 국가 건강 등록부를 통해 덴마크 vHL 환자를 식별하고 18세 이상의 환자에게 참여를 요청했습니다. 동의한 참여자들은 그들의 병력과 의무기록을 통해 확인된 정보에 대해 인터뷰를 하였다.

참가자의 VHL 생식계열 돌연변이는 말초 혈액 샘플에서 추출한 DNA를 사용하여 식별되며, 이 파일럿 프로젝트의 경우 엑손 및 엑손-인트론 경계 및 MLPA의 직접 시퀀싱을 사용하여 말초 림프구의 DNA에서 발견된 식별 가능한 병원성 VHL 생식계열 돌연변이가 있는 사람만 포함됩니다.

연구에서 참여자의 치료의 일부로 외과적으로 제거된 획득 가능한 모든 CNS 혈관모세포종의 조직 샘플은 파라핀 내장 조직, 신선한 냉동 조직 또는 RNAlater에서 보존된 신선한 조직으로 수집됩니다.

제안된 프로젝트의 경우 각 참여자로부터 최소 2개의 달성 가능한 CNS 혈관모세포종이 NGS 분석으로 선택됩니다. 연구자들은 파라핀 포매된 종양 조직, 신선한 동결 및 RNAlater에 현탁된 조직에서 추출한 DNA를 포함하여 최소 19개의 종양 샘플에서 DNA를 포함할 수 있을 것으로 기대합니다.

방법 각 참가자의 DNA를 종양 조직 및 정상 조직(즉, 말초 혈액) 표준 프로토콜을 사용합니다. 파라핀 포매 조직은 종양 조직과 정상 주변 조직을 모두 포함할 수 있습니다. 조직의 DNA가 종양 DNA를 나타내는지 확인하기 위해 조사관은 먼저 HE로 염색된 절편을 평가하고 조직 절편의 > 85%에 종양이 포함되어 있는지 확인합니다.

miRNA 및 lincRNA 유전자뿐만 아니라 모든 알려진 유전자를 포함하는 Niblegen 64Mb 패널을 사용하여 종양 및 정상 조직 DNA의 엑솜 농축을 수행합니다. 농축된 DNA는 Illumina Hiseq1500 플랫폼을 사용하여 2X100 염기의 페어드 엔드 시퀀싱과 평균 커버리지 비율 75-100 x를 사용하여 시퀀싱됩니다. 각 종양 DNA 샘플의 결과를 환자의 정상 조직의 DNA와 비교하여 생식계열 변이를 종양 특이적 유전자 변이와 구별함으로써 종양 DNA에 속하는 체세포 유전자 변이의 프로필을 얻습니다.

체세포 돌연변이는 VarScan, Mutect, EBCall 또는 Virmid와 같은 체세포 변이 콜러 소프트웨어를 사용하여 식별됩니다. 종양의 엑솜에 위치한 식별된 체세포 변이체를 평가하고, ngCGH, Contra 및 Nexus 소프트웨어를 사용하여 NGS 데이터의 복제수 프로파일링을 통해 체세포 복제수 이벤트를 식별합니다. 식별된 체세포 점 돌연변이는 표적화된 심층 시퀀싱을 사용하여 검증됩니다. 연구자들은 종양 전반에 걸쳐 반복되는 변이를 기반으로 염색체 후보 영역을 선택할 것입니다.

외과적 제거 전 각 종양의 임상적 특성은 각 참가자의 1년 동안의 연간 감시 및 추가 진단 검사에서 일련의 방사선 데이터(CNS의 MRI) 평가를 통해 평가됩니다.

1. 종양 크기: 종양 부피(너비 x 길이 x 높이) x 0.5(mm3)로 평가
2. 종양 발달 시간: 종양이 MRI에서 처음 보인 시점부터 수술 시점까지의 시간 간격으로 평가
3. 종양 성장 속도: 방사선학적 진행, 즉 종양 부피의 변화/두 MRI 사이의 시간 간격(개월)으로 평가
4. 종양 성장 단계: 수술 전 성장 단계가 종양이었는지 평가(정체 대 성장 단계는 최근 3개의 MRI 사이의 시간 간격에서 종양 부피의 변화로 정의됨)
5. 수술 전 관련 낭종 발달 및 낭종 크기: 수술 전 마지막 MRI에서 낭종 부피로 평가합니다.

이 임상 정보는 가능한 분자 동인에 대한 임상적 연관성을 평가하기 위해 종양의 유전적 프로필과 비교됩니다.