Drivere for hypoksi-indusert angiogenese i tumorutvikling

Bakgrunn Kreftcelleutvikling krever en rekke ervervede evner for å vokse og spre seg: 1) selvforsyning med vekstsignaler, 2) ufølsomhet for vekstinhiberingssignaler, 3) unndragelse av apoptose (programmert celledød), 4) ubegrenset replikativt potensial, 5 ) vedvarende angiogenese og 6) vevsinvasjon og metastase (Hanahan og Weinberg, 2000). Anskaffelsen av disse egenskapene er drevet av mutasjoner i sentrale onkogener og tumorsuppressorgener, selv om de eksakte mekanismene ennå ikke er fullt ut forstått. Spesielt angiogenese er avgjørende for en celles overlevelse siden dens fortsatte multiplikasjon avhenger av oksygenet og næringsstoffene som tilføres i vaskulaturen (Hanahan og Weinberg, 2000). Angiogenese kan initieres av mangel på oksygen (hypoksi), og cellens oksygenregistreringsvei medierer en respons. Under normale forhold og i nærvær av oksygen, VHL-proteinet, formidler pVHL bindingen av et ubiquitin-ligasekompleks til en gruppe transkripsjonsfaktorer kalt Hypoxia-inducible Factors (HIFs) og styrer HIF-α-underenhetene til proteosomal nedbrytning. I normale celler med nok oksygen hemmes således HIF-a-indusert transkripsjon av målgener. Under hypoksi hydroksyleres ikke HIF-α og blir derfor ikke gjenkjent av VHL-proteinet. HIF-ene translokerer til kjernen og induserer transkripsjon av en rekke gener, mange koder for angiogene faktorer som stimulerer vekst av nye kar (Maher et al., 2011; Nordstrom-O'Brien et al., 2010). Kreftvekst krever store mengder oksygen og de fleste tumorceller er i konstant hypoksi.

Hvis det ikke er funksjonell pVHL i en celle, reagerer den som om den trenger oksygen, da HIF-er vil stimulere angiogenese uavhengig av oksygennivåer. Derfor kan pasienter med kimlinjemutasjoner i VHL-genet tjene som en modell for hypoksi-indusert angiogenese. Pasienter med kimlinje-VHL-mutasjoner har von Hippel-Lindaus sykdom (vHL) og er utsatt for tumorutvikling på grunn av denne mekanismen, hovedsakelig nyrecellekarsinom og hemangioblastomer i sentralnervesystemet (Maher et al., 2011). Selv om hemangioblastomer er histologisk godartede svulster, kan de få alvorlige konsekvenser. Den naturlige utviklingen av hemangioblastomer er preget av uforutsigbare perioder med vekst og stagnasjon. Ofte utvikler de assosierte cyster som påvirker tilstøtende nervevev og forårsaker massive symptomer, da selv små volumendringer i hjernen kan forårsake alvorlig nevrologisk skade eller til og med død (Ammerman et al., 2006;Glasker et al., 2010; Wanebo et al. , 2003).

Mekanismene bak vHL-assosiert tumorgenese er komplekse og ennå ikke fullt ut forstått. En nøkkelhendelse er tap av et funksjonelt VHL-proteinprodukt som et resultat av inaktivering av begge alleler av VHL-genet i samsvar med Knudsons to hit-hypotese (Vortmeyer et al., 2013). Det er imidlertid også klart at selv om inaktivering av begge kopiene av en persons VHL-gen er nødvendig, ser det ikke ut til å være tilstrekkelig for utvikling av hemangioblastom (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004). Biallelisk VHL-inaktivering kan være tilstede i form av flere tumorforløpere gjennom predisponert vev, og de fleste utvikler seg aldri til faktiske symptomfremkallende svulster (Vortmeyer et al., 2013;Vortmeyer et al., 2006;Vortmeyer et al., 2004).

Nøkkelspørsmålet for en bedre forståelse av hvordan man bremser eller stopper tumorutvikling er identifisering av hvilke spesifikke tilleggsfaktorer som initierer eller fremmer tumorutvikling og -vekst. Tumorutvikling kan initieres i en enkelt celle som unngår normal kontroll av celledeling, men ettersom cellen deler seg og formerer seg, går dattercellene gjennom en sekvens av flere genetiske hendelser i mange forskjellige gener som akkumuleres og gir svulsten vekstfordeler ( Hanahan og Weinberg, 2011). En slik sekvens fra benignt adenom til ondartet karsinom har tidligere blitt kartlagt for utvikling av tykktarmskreft og har vært av enorm betydning for vår nåværende forståelse av kreftutvikling (Fearon og Vogelstein, 1990). Når det gjelder hemangioblastomer, vil ytterligere kunnskap om eventuelle vanlige genetiske hendelser i andre gener enn VHL-genet som oppstår i de tidlige stadiene av hemangioblastomprogresjon bidra til å bestemme hvilke spesifikke gener som kan være drivkraften, dvs. fremme vekst og/eller cysteutvikling.

En gruppe har nylig identifisert tap av HNF1B på kromosom 17q for å være en potensiell molekylær driver av hemangioblastoma tumorigenese ved å bruke analyse av kopiantallvariasjon i tumor-DNA (Sun M et al., 2014). Andre grupper har funnet bevis for at tap av ZAC1 på kromosom 6q spiller en stor rolle i både vHL-assosiert og sporadisk CNS hemangioblastom tumorigenese (Lemeta et al., 2007; Zhou et al., 2010). Imidlertid kan mer systematiske tilnærminger for å undersøke hemangioblastomers genetiske endringer i et bredere perspektiv markant øke vår kunnskap om sekvensen av genetiske hendelser som fører fra tidlig stadium tumorforløpere til fullvoksne svulster. Denne kunnskapen er av stor betydning, både i forhold til vår generelle forståelse av tumorigenese, men også i forhold til påvisning av tidlige nødvendige genetiske hendelser som oppstår i alle hemangioblastomer i tidlige stadier av tumorutvikling og kan være drivende for prosessen. Slike nødvendige hendelser i tumorforløpercellene kan brukes som biomarkører i vevsbiopsier eller tumorceller som kommer inn i blodstrømmen for å bestemme hvilke pasienter som har størst risiko for aggressiv tumorvekst. Til slutt, endringer i spesifikke gener som er kjent for å være nøkkeltrinn i å gjøre en svulstforløpere til klinisk signifikante svulster, vil være åpenbare kandidater å målrette mot i utviklingen av antitumormedisiner.

Nylig har neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS) blitt brukt med suksess for å bestemme genetiske profiler og sekvens av spesifikke genetiske hendelser i forhold til individuell tumorprogresjon i flere andre tumortyper, inkludert både sporadisk og vHL-assosiert nyrecellekarsinom (RCC) (Fisher) et al., 2014;Gossage et al., 2015;Gundem et al., 2015;Kroigard et al., 2015). NGS gjør det mulig å undersøke somatiske variasjoner i en svulsts hele genom (dvs. variasjoner som har utviklet seg spesifikt i svulstens DNA og ikke i pasientens kimlinje-DNA)(Nik-Zainal, 2014).

Studiens etterforskere antar at forskjellige CNS-hemangioblastomer deler genetiske endringer i spesifikke gener som fremmer eller initierer tumorutvikling fra celler med VHL-mangel, dvs. genetiske drivere for tumorutvikling. Etterforskerne antar videre at noen av disse genetiske endringene representerer trinn i sekvensen av hemangioblastomprogresjon. Ved å sammenligne genetiske endringer i svulster på forskjellige utviklingsstadier, med forskjellige vekstmønstre, og med og uten assosiert cysteutvikling, forsøker etterforskeren å belyse de mulige utviklingsrelaterte genetiske endringene som oppstår i denne sekvensen. Basert på hvor ofte genetiske varianter deles av de separate svulstene, kan det estimeres hvilke gener som sannsynligvis er involvert på forskjellige stadier i utviklingen av hemangioblastom. I dette pilotprosjektet planlegger etterforskerne å analysere separate svulster som stammer fra samme pasient, så vel som svulster som stammer fra forskjellige pasienter for å evaluere intra- og interpasientforskjeller.

Funn av kandidater for genetiske drivere i dette prosjektet vil senere bli bekreftet i en større serie av både vHL-assosierte så vel som sporadiske CNS-hemangioblastomer, som vil bli samlet inn i en pågående prosess. Etterforskerne planlegger også å sammenligne funnene med nylige funn av kandidater for genetiske drivere i nyrecellekarsinomer i et pågående prosjekt utført av noen av våre samarbeidspartnere.

Materiale Etterforskerne har identifisert danske vHL-pasienter gjennom flere nasjonale helseregistre, og bedt pasienter over 18 år om å delta. Samtykke deltakere ble intervjuet om deres medisinske historie og informasjonen bekreftet gjennom medisinske journaler.

Deltakernes VHL-kimlinjemutasjoner identifiseres ved hjelp av DNA ekstrahert fra perifere blodprøver, og for dette pilotprosjektet vil kun de med en identifiserbar patogen VHL-kimlinjemutasjon funnet i DNA fra perifere lymfocytter ved bruk av direkte sekvensering av eksoner og ekson-intron-grenser og MLPA. inkluderes.

I studien vil vevsprøver fra alle tilgjengelige CNS-hemangioblastomer som har blitt fjernet kirurgisk som en del av en deltakers behandling, samles, enten som parafininnstøpt vev, som ferskt frossent vev, eller som ferskt vev konservert i RNAlater.

For det foreslåtte prosjektet vil minst to oppnåelige CNS-hemangioblastomer fra hver deltaker bli valgt NGS-analyse. Etterforskerne forventer å kunne inkludere DNA fra minst 19 tumorprøver, inkludert DNA ekstrahert fra både parafininnstøpt tumorvev, fersk frossen og vev suspendert i RNAlater.

Metoder DNA fra hver deltaker isoleres fra tumorvev og fra normalt vev (dvs. perifert blod) ved bruk av standardprotokoller. Det parafininnstøpte vevet kan inneholde både tumorvev så vel som normalt omkringliggende vev. For å sikre at DNA fra vevet representerer tumor-DNA, vil etterforskerne først evaluere HE-fargede snitt og sikre at > 85 % av vevsseksjonen inneholder tumor.

Eksomberikelse av både tumor- og normaltvevs-DNA vil bli utført ved bruk av et Niblegen 64Mb-panel som inkluderer alle kjente gener samt miRNA- og lincRNA-gener. Det anrikede DNAet vil bli sekvensert ved hjelp av Illumina Hiseq1500-plattformen med paret endesekvensering av 2X100 baser og en gjennomsnittlig dekningshastighet på 75-100 x. Resultatene fra hver tumor-DNA-prøve vil bli sammenlignet med DNA pasientens normale vev for å skille kimlinjevariasjoner fra tumorspesifikke genetiske endringer og derved oppnå profilen til somatiske genetiske endringer som tilhører tumor-DNA.

Somatiske mutasjoner vil bli identifisert ved å bruke somatisk variant av oppringerprogramvare som VarScan, Mutect, EBCall eller Virmid. Identifiserte somatiske varianter lokalisert til svulstens eksom vil bli vurdert, og somatiske kopinummerhendelser vil bli identifisert gjennom kopinummerprofilering av NGS-dataene ved hjelp av ngCGH, Contra og Nexus programvare. Identifiserte somatiske punktmutasjoner vil bli validert ved hjelp av målrettet dypsekvensering. Etterforskerne vil velge kromosomale kandidatregioner basert på tilbakevendende varianter på tvers av svulster.

Hver svulsts kliniske egenskaper før kirurgisk fjerning vil bli vurdert gjennom evaluering av serielle radiologiske data (MRI av CNS) fra hver deltakers årelange årlige overvåking og ytterligere diagnostiske undersøkelser:

1. Tumorstørrelse: Vurdert etter tumorvolum (bredde x lengde x høyde) x 0,5 (mm3)
2. Tumorutviklingstid: Vurdert etter tidsintervall fra svulsten var først synlig på MR til operasjonstidspunktet
3. Tumorveksthastighet: Vurdert ved radiologisk progresjon, dvs. endring i tumorvolum/tidsintervall mellom to MR-er (måneder)
4. Tumorvekstfase: Vurdert ved hvilken vekstfase svulsten var i før operasjonen (stillestående vs. vekstfase definert av endring i tumorvolum i tidsintervallene mellom de siste tre MR-ene)
5. Assosiert cysteutvikling og cystestørrelse før operasjon: Vurdert ved cystevolum ved siste MR før operasjon.

Denne kliniske informasjonen vil bli sammenlignet med svulstens genetiske profil for å vurdere eventuelle kliniske assosiasjoner til mulige molekylære drivere.