Identificazione dei doppi marcatori di organi danneggiati dalla sepsi dell'insufficienza d'organo mediante l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle fluorescenti

Contesto: la sepsi, definita come disfunzione d'organo pericolosa per la vita a causa di una risposta dell'ospite disregolata all'infezione, continua ad essere una fonte di considerevole morbilità e mortalità. 19 milioni di casi vengono osservati in tutto il mondo ogni anno. Molti modelli di sepsi animale avevano scoperto che la sepsi induceva insufficienza multiorgano. L'ubiquitinazione, l'autofagia, l'apoptosi possono comportare il processo di insufficienza multiorgano correlata alla sepsi. Gli studi di proteomica basati sulla spettrometria di massa nelle popolazioni cliniche e nei modelli animali di roditori e mammiferi erano iniziati con la scoperta di molti nuovi biomarcatori di sepsi. Gli esosomi trovati nel sangue o nelle urine presentavano il segnale dell'autofagia e dell'apoptosi. Recentemente, l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è stata utilizzata come nuovo metodo per l'analisi diretta e in tempo reale degli esosomi. Questi consentono di studiare i biomarcatori dell'esosoma per analizzare i pazienti settici con insufficienza multiorgano.

Obiettivi dello studio: Questa ricerca sarà il primo studio non solo a creare macrofagi co-coltivati ​​con modelli di cellule di organi umani per le secrezioni di esosomi, ma anche a raccogliere esosomi purificati nel sangue e nelle urine di pazienti settici. Studi di proteomica in esosomi da colture cellulari e campioni clinici. Analizza i biomarcatori degli esosomi correlati all'ubiquitinazione, all'autofago e all'apoptosi mediante bioinformatica. Utilizzare NTA per impostare nuovi metodi diagnostici, per giudicare il danno d'organo specifico del paziente settico dai biomarcatori dell'autofagia-apoptosi degli esosomi.

Materiali e Metodi: Nel 1° anno, verranno allestiti macrofagi stimolati con LPS (lipopolisaccaridi) co-coltivati ​​con cellule di organi umani. Gli esosomi saranno isolati e purificati da diversi gruppi. ScFv (single chain fragments of antibody) sarà selezionato per bloccare la trasmissione dell'esosoma correlato all'infezione. Il 2° anno verranno inclusi un totale di 60 pazienti con infezione e risultati colturali positivi, di cui 30 pazienti settici con almeno un'insufficienza d'organo, altri avranno solo infezione. Tutti i pazienti inclusi e classificati secondo i criteri di sepsi-3. I campioni clinici saranno raccolti da agosto 2017 a luglio 2019. L'esosoma sarà isolato e purificato. La purificazione di biglie magnetiche, l'elettroforesi su gel 2D, MALDI-TOF e la bioinformatica saranno utilizzate per analizzare la proteomica degli esosomi e l'associazione di marcatori organo-specifici, autofagia e marcatori di apoptosi. Verrà effettuato il western blotting per provare le proteine ​​trovate dalla proteomica. Anche l'array di citochine nel sangue conferma e si correla all'autofagia. Infine, utilizzeremo l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle con l'identificazione di marcatori doppi per comprendere le sottopopolazioni esosomiche di specifici biomarcatori di organi e autofagia-apoptosi.

Possibile effetto: verrà effettuata l'istituzione sistematica della proteomica dell'esosoma nel terreno di co-coltura e nei campioni di sepsi clinica. Lo studio in vitro, l'esplorazione di ScFv aiuterà a bloccare l'assorbimento degli exsomi come possibile metodo terapeutico. I biomarcatori di ubiquitinazione-autofagia-apoptosi negli esosomi saranno rilevati e correlati a specifiche insufficienza d'organo nella sepsi. Il processo infiammatorio sarà inoltre validato dall'analisi delle citochine. L'identificazione dei doppi marcatori NTA sarà un metodo intelligente per comprendere le sottopopolazioni esosomiche.