Eterogeneità del tumore nel linfoma diffuso a grandi cellule B in relazione al coinvolgimento del sistema nervoso centrale e al DNA libero da cellule

Solo circa il 60% dei pazienti con linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) viene curato con chemio e immunoterapia standard, con R-CHOP (rituximab, ciclofosfamide, doxorubicina cloridrato, oncovin, prednisone).

L'identificazione precoce e più accurata dei pazienti con prognosi sfavorevole dopo R-CHOP consentirà al medico di trovare pazienti che necessitano di altre strategie terapeutiche. Sono necessari nuovi biomarcatori predittivi per prevedere l'effetto del trattamento a livello individuale.

Una percentuale di pazienti ha o sviluppa un coinvolgimento del linfoma del sistema nervoso centrale (SNC) e questo gruppo ha un esito particolarmente negativo. Anche l'identificazione di pazienti con coinvolgimento primario subclinico o successivamente manifesto del sistema nervoso centrale richiede metodi diagnostici nuovi e migliorati. Attualmente, un numero di parametri clinici è incluso in un punteggio di rischio CNS-IPI, che può essere utilizzato per prevedere il rischio di malattia del SNC. Questo punteggio consente ai medici di decidere se i pazienti debbano sottoporsi a chemioterapia profilattica per prevenire lo sviluppo della malattia del SNC. Tuttavia, questo modello di rischio è lungi dall'essere accurato e l'effetto del trattamento profilattico si basa su un basso livello di evidenza.

Il DLBCL è una malattia altamente eterogenea, come evidenziato dai 19 sottotipi e varianti di diagnosi di linfoma a grandi cellule B presenti nella classificazione dell'OMS dei tumori dei tessuti ematopoietici e linfoidi. Tuttavia, anche il cancro all'interno di ciascun paziente è caratterizzato da eterogeneità. Il fatto che diverse cellule di linfoma possano coesistere nello stesso tumore è noto da decenni. Un esempio di ciò è la trasformazione del linfoma indolente in un sottotipo di linfoma più aggressivo, spesso DLBCL in cui i due tipi di cellule di linfoma si trovano nello stesso linfonodo. Le differenze tra le cellule tumorali nello stesso tumore sono definite eterogeneità intratumorale. Tali differenze possono essere trovate all'interno dello stesso tumore così come in posizioni spazialmente separate (eterogeneità intertumorale). L'eterogeneità intratumorale può avere un impatto importante sul decorso clinico e sulla risposta alla terapia. Nella pratica clinica, la prognosi nei pazienti con stadio clinico e punteggio dell'indice prognostico internazionale (IPI) simile è spesso diversa. Tali differenze possono essere attribuite all'eterogeneità sia intra che intertumorale. La profilazione molecolare (mutazioni) in diversi siti nodali ed extranodali all'interno dello stesso paziente non è stata studiata prima in coorti più ampie di pazienti con DLBCL (eterogeneità intertumorale).

Il monitoraggio del DNA tumorale libero da cellule circolanti (ctDNA) ha il potenziale per fungere da strumento non invasivo per misurare l'intero spettro di aberrazioni genetiche riscontrate in un singolo paziente come alternativa a procedure diagnostiche più invasive.

Presentazione clinica di DLBCL:

Il DLBCL è il tipo più comune di linfoma e rappresenta circa il 40% dei linfomi non Hodgkin negli adulti in Danimarca (500 nuovi casi all'anno). Il DLBCL può insorgere de novo o dalla trasformazione istologica di linfomi più indolenti, più comunemente il linfoma follicolare (FL) e la leucemia linfocitica cronica (LLC). Il DLBCL colpisce principalmente i pazienti anziani con un'età media alla diagnosi di quasi 70 anni. I pazienti possono presentare un coinvolgimento sia linfonodale che extranodale. Più di un coinvolgimento extranodale è un fattore prognostico negativo e alcuni siti sono associati a un rischio più elevato di avere o sviluppare un coinvolgimento del SNC (ad es. testicolo, ghiandole surrenali, utero).

Il DLBCL è caratterizzato come una malattia clinicamente eterogenea con un esito variabile, tuttavia è potenzialmente curabile. R-CHOP è la terapia standard per i pazienti con DLBCL. La sopravvivenza libera da progressione (PFS) a 5 anni è di circa il 60%. Tuttavia, oltre il 30% dei pazienti trattati con R-CHOP non risponde o presenta una ricaduta, con la maggior parte di questi pazienti che soccombe alla malattia. Nonostante i modelli di rischio come l'indice prognostico internazionale (IPI) e il CNS-IPI, i pazienti con un alto rischio di fallimento del trattamento, recidiva o coinvolgimento del sistema nervoso centrale non possono essere identificati con precisione dai fattori prognostici standard. Pertanto, nuovi fattori prognostici e biomarcatori sono sotto indagine alla diagnosi, per identificare meglio quei pazienti ad alto rischio, che potrebbero beneficiare di una strategia terapeutica alternativa.

Obiettivi e prospettive del progetto:

La nostra attuale comprensione dei meccanismi molecolari associati alla recidiva di DLBCL è limitata. Al momento non è chiaro se l'eterogeneità clonale nei tumori primari abbia un ruolo nella recidiva di DLBCL. Il nostro studio si basa sull'ipotesi che subcloni divergenti diano origine al tumore recidivato in uno scenario divergente precoce. Questo scenario suggerisce che alla diagnosi esistono diversi cloni divergenti oltre a quello che dà origine alla recidiva. Pertanto, le informazioni riguardanti l'eterogeneità intratumorale e l'evoluzione clonale della malattia possono fornire una migliore comprensione del DLBCL e lo sviluppo di fattori prognostici riguardanti l'identificazione dei pazienti con DLBCL ad alto rischio. Se il tumore è eterogenico, come hanno indicato gli studi sul ctDNA, potrebbe potenzialmente trasformare il paradigma della cura clinica. Potrebbe forse spiegare il diverso esito nei pazienti con presentazione clinica simile, o perché alcuni pazienti sviluppano un coinvolgimento del sistema nervoso centrale. Inoltre, la conoscenza dell'eterogeneità del tumore potrebbe guidare il medico nella scelta del trattamento e nello sviluppo del protocollo e quindi migliorare l'esito per i pazienti.

Se l'eterogeneità potesse essere rilevata nel ctDNA, potrebbe essere resa operativa e i pazienti potrebbero evitare procedure bioptiche invasive. L'evoluzione dinamica del tumore potrebbe forse essere monitorata anche dal ctDNA per quanto riguarda il carico tumorale correlato alla PET-TC intermedia e alla fine del trattamento e all'intensità del trattamento.

Gli attuali modelli genomici in DLBCL si basano principalmente su singole biopsie tumorali. Trovano un ampio spettro di mutazioni tra i pazienti. I modelli di singolo tumore possono sottostimare la possibile eterogeneità tra i siti tumorali nel singolo paziente. Inoltre, l'eterogeneità, i dati sull'evoluzione mutazionale e la relazione con il coinvolgimento del SNC rimangono in gran parte sconosciuti. La nostra configurazione consentirà di chiarire l'eterogeneità all'interno del singolo paziente e di indagare la relazione con la prognosi e il coinvolgimento del SNC.

Obiettivo primario dello studio:

- Identificare il pattern e le variazioni delle mutazioni nei diversi siti di linfoma nei singoli pazienti

Obiettivi secondari:

• Identificare l'eterogeneità intertumorale tra siti nodali ed extranodali
• Identificare l'associazione tra eterogeneità intertumorale e rischio di coinvolgimento del SNC
• Per identificare l'evoluzione clonale e la relazione clonale tra il sito del tumore primario e il tumore alla recidiva
• Esplorare il ruolo delle "biopsie liquide" e del ctDNA nel monitoraggio dell'eterogeneità intertumorale
• Per identificare l'eterogeneità tra i siti nodali e la biopsia del midollo osseo.
• L'eterogeneità inter-paziente identificata con il nostro pannello di linfoma clinico locale può essere utilizzata per suddividere i pazienti secondo la classificazione di Wright

Test clinici:

Il progetto consisterà in uno studio retrospettivo e uno studio osservazionale e clinico.

5.1 Studio retrospettivo - coorte A - Marcatori specifici in pazienti con DLBCL

La prima parte dello studio retrospettivo, coorte A, sarà uno studio di diverse biopsie prelevate dallo stesso paziente. Le biopsie da diversi siti nodali e/o extranodali sono state prelevate contemporaneamente o in momenti diversi nel corso del trattamento. Il periodo di tempo è 2015-2019.

L'obiettivo con la coorte A è quello di esplorare i campioni bioptici per vari scopi:

• Le biopsie effettuate in tempi diversi: ci danno la possibilità di osservare l'evoluzione clonale nel tempo.
• Le biopsie, prelevate contemporaneamente, ma da siti diversi: ci danno la possibilità di osservare l'eterogeneità intertumorale in un paziente.

I risultati di diversi siti dello stesso paziente saranno confrontati e utilizzati per sottoraggruppare il paziente secondo l'algoritmo di Wright. Tutte le analisi saranno eseguite su materiale bioptico incluso in paraffina.

Studio retrospettivo - coorte B - Marcatori specifici in pazienti con DLBCL e coinvolgimento secondario del SNC

Nello studio retrospettivo - coorte B, i ricercatori esplorano l'eterogeneità e l'evoluzione clonale tra linfoma del SNC e siti nodali/extra-nodali utilizzando biopsie già raccolte.

Gli investigatori esamineranno i pazienti con entrambe le malattie sistemiche e il coinvolgimento del sistema nervoso centrale.

Il periodo di tempo è: 2010-2019

L'obiettivo con la coorte B è quello di esplorare i campioni bioptici per vari scopi:

• Le biopsie, prelevate da diversi siti (CNS vs sistemica) ci danno la possibilità di osservare l'eterogeneità intertumorale e la possibile evoluzione clonale.
• Le biopsie effettuate in tempi diversi: ci danno la possibilità di osservare l'evoluzione clonale nel tempo

Confrontando i nostri risultati della coorte retrospettiva A, l'obiettivo è definire possibilmente mutazioni particolarmente importanti che sono presenti solo nei pazienti la cui malattia si è diffusa al sistema nervoso centrale. La conoscenza delle mutazioni che possono predisporre al coinvolgimento del SNC sarebbe essenziale per identificare i pazienti con questo rischio.

I risultati di diversi siti dello stesso paziente saranno confrontati e utilizzati per sottoraggruppare il paziente secondo l'algoritmo di Wright. Tutte le analisi saranno eseguite su materiale bioptico incluso in paraffina.

Studio prospettico - coorte A e B - Eterogeneità nei pazienti con linfoma

Lo studio prospettico includerà due diverse coorti:

A: Pazienti con DLBCL con interessamento di linfoma di diversi siti linfonodali accessibili per biopsia e midollo osseo.

B: Pazienti con DLBCL con entrambi i siti nodali ed extra-nodali accessibili per biopsia e midollo osseo.

Lo studio prospettico includerà pazienti con nuova diagnosi di DLBCL. I pazienti saranno inclusi nella coorte A o B in base alla localizzazione della malattia accertata mediante PET-TC per chiarire il coinvolgimento linfonodale vs extranodale.

Coorte A - pazienti con più di un sito linfonodale: verrà eseguita un'ulteriore biopsia per la valutazione clinica da una posizione diversa da quella in cui è stata eseguita la biopsia diagnostica. Queste biopsie possono esplorare l'eterogeneità all'interno del paziente nei siti nodali.

Le biopsie del midollo osseo disponibili saranno analizzate come sito separato.

Coorte B - pazienti con siti sia linfonodali che extranodali: una biopsia per la valutazione clinica verrà eseguita da un sito diverso rispetto alla biopsia diagnostica, risultando in una biopsia linfonodale e una extranodale. Queste biopsie esploreranno l'eterogeneità tra siti nodali ed extra-nodali all'interno del paziente.

Eventuali biopsie del midollo osseo disponibili verranno analizzate come sito separato.