Heterogenita tumoru u difuzního velkobuněčného B-lymfomu ve vztahu k postižení CNS a bezbuněčné DNA

Pouze asi 60 % pacientů s difuzním velkobuněčným B-lymfomem (DLBCL) je vyléčeno standardní chemo- a imunoterapií s R-CHOP (Rituximab, cyklofosfamid, doxorubicin hydrochlorid, oncovin, prednison).

Včasná a přesnější identifikace pacientů s nepříznivou prognózou po R-CHOP umožní klinickému lékaři najít pacienty, kteří potřebují jiné léčebné strategie. Pro predikci efektu léčby na individuální úrovni jsou potřeba nové prediktivní biomarkery.

Část pacientů má nebo se u nich rozvine lymfom postižení centrálního nervového systému (CNS) a tato skupina má zvláště tristní výsledek. Identifikace pacientů s primárním subklinickým nebo později manifestním postižením CNS vyžaduje také nové a vylepšené diagnostické metody. V současné době je do skóre rizika CNS-IPI zahrnuta řada klinických parametrů, které lze použít k predikci rizika onemocnění CNS. Toto skóre umožňuje lékařům rozhodnout, zda by pacienti měli podstoupit profylaktickou chemoterapii, aby se zabránilo rozvoji onemocnění CNS. Tento model rizika však není ani zdaleka přesný a účinek profylaktické léčby je založen na nízké úrovni důkazů.

DLBCL je vysoce heterogenní onemocnění, o čemž svědčí 19 podtypů a variant diagnóz velkobuněčného B-lymfomu nalezených v klasifikaci WHO nádorů hematopoetických a lymfoidních tkání. Rakovina u každého pacienta je však také charakterizována heterogenitou. Skutečnost, že různé lymfomové buňky mohou koexistovat ve stejném nádoru, je známá již desítky let. Jedním z příkladů je transformace indolentního lymfomu na agresivnější podtyp lymfomu, často DLBCL, kde se dva typy lymfomových buněk nacházejí ve stejné lymfatické uzlině. Rozdíly mezi rakovinnými buňkami ve stejném nádoru se nazývají intratumorová heterogenita. Takové rozdíly lze nalézt ve stejném nádoru i v prostorově oddělených místech (intertumorová heterogenita). Intratumorová heterogenita může mít významný dopad na klinický průběh a odpověď na terapii. V klinické praxi je prognóza u pacientů s podobným klinickým stadiem a skóre Mezinárodního prognostického indexu (IPI) často rozdílná. Tyto rozdíly lze přičíst jak intratumorové, tak intertumorové heterogenitě. Molekulární profilování (mutace) v různých uzlinových a extranodálních místech u stejného pacienta dosud nebylo studováno u větších kohort pacientů s DLBCL (intertumorová heterogenita).

Monitorování cirkulující bezbuněčné nádorové DNA (ctDNA) má potenciál sloužit jako neinvazivní nástroj pro měření celého spektra genetických aberací zjištěných u jednotlivého pacienta jako alternativa k invazivnějším diagnostickým postupům.

Klinický obraz DLBCL:

DLBCL je nejběžnějším typem lymfomu a představuje přibližně 40 % nehodgkinských lymfomů u dospělých v Dánsku (500 nových případů ročně). DLBCL může vzniknout de novo nebo z histologické transformace více indolentních lymfomů, nejčastěji folikulárního lymfomu (FL) a chronické lymfocytární leukémie (CLL). DLBCL primárně postihuje starší pacienty s mediánem věku při diagnóze téměř 70 let. Pacienti mohou mít postižení uzlin i mimouzlin. Více než jedno extranodální postižení je negativní prognostický faktor a některá místa jsou spojena s vyšším rizikem postižení nebo rozvoje CNS (např. varlata, nadledvinky, děloha).

DLBCL je charakterizováno jako klinicky heterogenní onemocnění s proměnlivým výsledkem, je však potenciálně léčitelné. R-CHOP je standardní terapií pro pacienty s DLBCL. Pětileté přežití bez progrese (PFS) se pohybuje kolem 60 %. Více než 30 % pacientů léčených R-CHOP však nereaguje nebo dochází k relapsu, přičemž většina těchto pacientů svému onemocnění podlehne. Navzdory rizikovým modelům, jako je International Prognostic Index (IPI) a CNS-IPI, nelze pacienty s vysokým rizikem selhání léčby, relapsu nebo postižení CNS přesně identifikovat standardními prognostickými faktory. Proto jsou při diagnóze zkoumány nové prognostické faktory a biomarkery, aby bylo možné lépe identifikovat vysoce rizikové pacienty, kteří mohou mít prospěch z alternativní terapeutické strategie.

Cíle a perspektivy projektu:

Naše současné chápání molekulárních mechanismů spojených s relapsem DLBCL je omezené. V současné době není jasné, zda klonální heterogenita primárních nádorů hraje roli v relapsu DLBCL. Naše studie je založena na hypotéze, že divergentní subklony vedou ke vzniku relapsu tumoru v časně divergentním scénáři. Tento scénář naznačuje, že při diagnóze existuje několik odlišných klonů kromě toho, který vede k relapsu. Informace týkající se intratumorové heterogenity a klonálního vývoje onemocnění tedy mohou poskytnout lepší pochopení DLBCL a vývoj prognostických faktorů týkajících se identifikace pacientů s vysokým rizikem DLBCL. Pokud je nádor heterogenní, jak ukázaly studie ctDNA, mohl by potenciálně změnit paradigma klinické péče. Mohlo by to možná vysvětlit různé výsledky u pacientů s podobným klinickým projevem nebo proč se u některých pacientů rozvine postižení CNS. Kromě toho by znalost heterogenity nádoru mohla klinického lékaře vést při volbě léčby a vývoji protokolu, a tím zlepšit výsledky pro pacienty.

Pokud by byla v ctDNA detekována heterogenita, mohla by být zprovozněna a pacienti by se mohli vyhnout invazivním bioptickým postupům. Dynamický vývoj nádoru by snad mohl být také sledován pomocí ctDNA s ohledem na nádorovou zátěž související s mezidobí a koncem léčby PET-CT a intenzitou léčby.

Současné genomové modely v DLBCL jsou založeny hlavně na biopsiích jednoho nádoru. Mezi pacienty nacházejí široké spektrum mutací. Modely jednoho nádoru mohou podceňovat možnou heterogenitu mezi místy nádoru u jednotlivého pacienta. Kromě toho, heterogenita, údaje o mutační evoluci a vztah s postižením CNS zůstávají do značné míry neznámé. Naše nastavení umožní objasnit heterogenitu u jednotlivého pacienta a prozkoumat vztah k prognóze a postižení CNS.

Primární cíl studie:

- Identifikovat vzor a variace mutací v různých lokalizacích lymfomu u jednotlivých pacientů

Sekundární cíle:

• Identifikovat mezinádorovou heterogenitu mezi uzlovými a extra nodálními místy
• Identifikovat souvislost mezi intertumorovou heterogenitou a rizikem postižení CNS
• Identifikovat klonální evoluci a klonální vztah mezi místem primárního nádoru a nádorem při relapsu
• Prozkoumat roli „tekuté biopsie“ a ctDNA při monitorování intertumorové heterogenity
• Identifikovat heterogenitu mezi uzlovými místy a biopsií kostní dřeně.
• Heterogenita mezi pacienty identifikovaná naším lokálním panelem klinických lymfomů může být použita k rozdělení pacientů podle Wrightovy klasifikace

Klinické testy:

Projekt se bude skládat z retrospektivní studie a observační a klinické studie.

5.1 Retrospektivní studie – kohorta A – Specifické markery u pacientů s DLBCL

První část retrospektivní studie, kohorta A, bude studiem různých biopsií odebraných od stejného pacienta. Biopsie z různých uzlinových a/nebo extrauzlových míst byly odebrány buď ve stejnou dobu, nebo v různých časech léčebného cyklu. Časové období je 2015-2019.

Cílem kohorty A je prozkoumat vzorky biopsie pro různé účely:

• Biopsie odebrané v různých časech: dávají nám možnost podívat se na klonální evoluci v průběhu času.
• Biopsie odebrané ve stejnou dobu, ale z různých míst: nám dávají možnost podívat se na mezinádorovou heterogenitu u jednoho pacienta.

Výsledky z různých míst od stejného pacienta budou porovnány a použity k podskupině pacienta podle Wrightova algoritmu. Všechny analýzy budou provedeny na bioptickém materiálu zalitém v parafínu.

Retrospektivní studie - kohorta B - Specifické markery u pacientů s DLBCL a sekundárním postižením CNS

V retrospektivní studii – kohorta B vyšetřovatelé zkoumají heterogenitu a klonální evoluci mezi lymfomem CNS a uzlovými/extranodálními místy pomocí již odebraných biopsií.

Vyšetřovatelé se zaměří na pacienty se systémovým onemocněním a postižením centrálního nervového systému.

Časové období je: 2010-2019

Cílem kohorty B je prozkoumat vzorky biopsie pro různé účely:

• Biopsie odebrané z různých míst (CNS vs. systémové) nám dávají možnost podívat se na mezinádorovou heterogenitu a možnou klonální evoluci.
• Biopsie odebrané v různých časech: dávají nám možnost podívat se na klonální evoluci v průběhu času

Srovnáním našich výsledků z retrospektivní kohorty A je cílem případně definovat zvláště důležité mutace, které jsou přítomny pouze u pacientů, jejichž onemocnění se rozšířilo do centrálního nervového systému. Znalost mutací, které mohou predisponovat k postižení CNS, by byla zásadní pro identifikaci pacientů s tímto rizikem.

Výsledky z různých míst od stejného pacienta budou porovnány a použity k podskupině pacienta podle Wrightova algoritmu. Všechny analýzy budou provedeny na bioptickém materiálu zalitém v parafínu.

Prospektivní studie - kohorta A a B - Heterogenita u pacientů s lymfomem

Prospektivní studie bude zahrnovat dvě různé kohorty:

A: Pacienti s DLBCL s postižením lymfomu na několika uzlových místech dostupných pro biopsii a kostní dřeň.

B: Pacienti s DLBCL s oběma uzlovými i extranodálními místy dostupnými pro biopsii a kostní dřeň.

Prospektivní studie bude zahrnovat nově diagnostikované pacienty s DLBCL. Pacienti budou zařazeni buď do kohorty A nebo B podle lokalizace onemocnění zjištěné pomocí PET-CT k objasnění postižení uzlin vs.

Kohorta A – pacienti s více než jedním uzlovým místem: Jedna další biopsie pro klinické hodnocení bude provedena z jiného místa, než kde byla provedena diagnostická biopsie. Tyto biopsie mohou prozkoumat heterogenitu pacienta v uzlových místech.

Dostupné biopsie kostní dřeně budou analyzovány jako samostatné místo.

Kohorta B – pacienti s uzlovými i mimouzlovými lokalizacemi: Jedna biopsie pro klinické hodnocení bude provedena z jiného místa, než je diagnostická biopsie, výsledkem bude jedna uzlová a jedna extranodální biopsie. Tyto biopsie prozkoumají heterogenitu mezi uzlovými a mimouzlovými místy u pacienta.

Jakékoli dostupné biopsie kostní dřeně budou analyzovány jako samostatné místo.