Trasferimento di cellule T regolatorie adottive autologhe nelle malattie autoimmuni.

Le malattie autoimmuni sono malattie croniche causate dalla rottura della tolleranza nei confronti degli autoantigeni

; un'ipotesi implica un fallimento nella tolleranza centrale e periferica, quest'ultima associata a un numero ridotto di cellule Treg (CD4+CD25+FpxP3CD127- T-regolatorie) o al fallimento della loro funzione (6).

Negli studi preclinici, le cellule CD4+CD25+CD127-Treg umane si sono dimostrate efficaci nella prevenzione della malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD) (7, 23), delle malattie autoimmuni (13,22) e nel ritardare il rigetto del trapianto (19, 26 ).

I risultati positivi hanno fornito la motivazione per applicare le cellule Treg per il trattamento delle malattie umane e i risultati dei primi studi clinici con ricercatori di cellule Treg trasferiti in modo adottivo pubblicati nel 2009 (24).

Cosa aggiunge questo studio? Questo è il primo studio interventistico sul trasferimento adottivo di cellule Treg in Egitto come sperimentazione terapeutica per pazienti con malattie autoimmuni refrattarie che non rispondono al trattamento di base disponibile nell'istituto. La separazione di queste cellule Treg è stata effettuata in pazienti egiziani, ma solo come studio descrittivo (come indicato di seguito).

i ricercatori scelgono due malattie per dare qualche possibilità di successo per ottenere fondi per la nostra ricerca, poiché il suo costo è costoso. I ricercatori hanno scelto queste due malattie (nefrite lupica refrattaria e diabete di tipo 1 negli adulti, in quanto sono le prove più comuni nella pubblicazione internazionale).

i ricercatori valuteranno la sicurezza e l'efficacia del trasferimento di cellule Treg adottive autologhe (CD4CD25FoxP3 CD127 a bassa regolazione) a pazienti con malattie autoimmuni refrattarie: lupus refrattario nefrite e diabete mellito di tipo 1 negli adulti.

2. DOMANDA DELLO STUDIO/SCOPO/OBIETTIVI i ricercatori valuteranno la sicurezza e l'efficacia del trasferimento di cellule Treg adottive autologhe (CD4CD25FoxP3 CD127low Regulator) a pazienti affetti da LES con nefrite lupica refrattaria e pazienti con diabete mellito di tipo 1 dell'adulto.

Il piano di monitoraggio degli eventi avversi è documentato nel protocollo di controllo degli eventi avversi sistemici e locali utilizzando CTCAE(5). Le valutazioni della sicurezza consisteranno nel monitoraggio continuo e nella segnalazione degli eventi avversi (EA) (con visite mensili o come visite ai pazienti); monitoraggio dei segni vitali, esami fisici e valutazioni di laboratorio. Verrà eseguita una documentazione precisa e una corretta gestione per qualsiasi evento avverso che possa verificarsi (nelle unità ambulatoriali e di ricovero come indicato). I pazienti saranno visitati mensilmente per il rilevamento di eventuali eventi avversi o come valutati clinicamente dal contatto Mobil.

1. Conta dei globuli bianchi (WBC) con conta differenziale, conta dei globuli rossi (RBC), conta delle piastrine (PLT), emoglobina (Hb) ed ematocrito (Hct).

2. Funzionalità epatica, test di funzionalità renale e misurazione degli elettroliti.

   Efficacia del trasferimento di cellule Treg adottive:

   • Valutazione clinica: anamnesi completa ed esame clinico approfondito con valutazione del punteggio di attività della malattia (clinicamente e di laboratorio) da confrontare con i dati basali.

   • Test di laboratorio secondo il tipo di malattia autoimmune:

     1. Test di laboratorio per il rilevamento di esacerbazione della malattia,
     2. CD4CD25FoxP3,CD127basso numero di cellule nel campione di sangue periferico,
     3. Rilevazione delle citochine sieriche (INF-gama,TNF-alfa,IL1,IL2,TGF-beta,IL-10,IL-17)

   • Valutazione radiologica se necessaria in base al tipo di malattia autoimmune:

     1. Ultrasuoni
     2. TAC
   • I ricercatori rileveranno l'efficacia dell'infusione di cellule T reg dopo 3 mesi, dopo 6 mesi e dopo un anno di somministrazione.
3. METODOLOGIA:

Tipo di studio: studio pilota di fase 1 in aperto non randomizzato Impostazione dello studio: tabella delle responsabilità (tabella 1): vedere sotto Durata dello studio: due anni.

Popolazione di studio:

• Dieci pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES) con nefrite lupica refrattaria: criteri di inclusione ed esclusione
• Dieci pazienti diabetici di tipo 1: criteri di inclusione ed esclusione

Metodo di campionamento:

Campioni mirati seguendo criteri di inclusione ed esclusione preimpostati.

Misura di prova:

I ricercatori includeranno dieci pazienti in ciascuna malattia autoimmune come studio pilota.

Procedure di studio:

• Prima visita: il team di reumatologia e il team di endocrinologia selezioneranno i pazienti secondo i criteri sopra menzionati dal dipartimento di medicina interna degli ospedali ASU. Le indagini di laboratorio e immunologiche complete saranno eseguite nei laboratori centrali dell'ospedale ASU. Gli infermieri dell'ambulatorio medico degli Ospedali dell'ASU preleveranno i campioni di sangue di tutti i casi. I pazienti eseguiranno tutte le modalità di imaging richieste nel dipartimento di radiodiagnosi, ospedale ASU. Il team di reumatologia e il team di endocrinologia richiederanno un consenso scritto da tutti i pazienti inclusi nello studio.
• Seconda visita: Dopo la prima visita entro una settimana. Il paziente arriverà al reparto di medicina interna. Tutti i pazienti saranno valutati clinicamente, di laboratorio e radiologici come indicato per il rilevamento della gravità o dell'attività della malattia. Il paziente andrà al centro di ricerca medica per il prelievo di sangue periferico in condizioni sterili per la separazione delle cellule Treg. La distanza tra il Centro di ricerca ei reparti medici è di circa 200 m. L'auto di trasferimento dell'ospedale trasferirà il paziente (golf car) per 150 m dopo aver camminato per 50 m.
• Terza visita: (dopo la seconda visita entro sei settimane): il paziente verrà al Centro di ricerca medica per l'ammissione sotto la supervisione del team di allergologia e immunologia per la somministrazione dell'infusione di cellule T reg. Il team di allergia e immunologia seguirà il paziente per 24 ore dopo l'infusione.
• La rilevazione di eventi avversi sarà controllata mensilmente. Il contatto mobile tra il paziente e i team di reumatologia, endocrinologia e immunologia clinica sarà mantenuto per la registrazione di qualsiasi evento avverso.
• Quarta visita: (dopo tre mesi dalla terza visita): il team medico eseguirà un follow-up completo di laboratorio, immunologico e radiologico nel laboratorio centrale dell'ASU e nel dipartimento di radiologia dell'ASU dopo tre mesi di infusione di T reg. Verranno registrati il ​​​​punteggio clinico e il rilevamento dell'attività e della gravità della malattia.
• Quinta visita dopo sei mesi di infusione. Lo stesso sarà fatto come visita 4.
• Visita finale dopo un anno per il rilevamento di qualsiasi evento avverso.
• Il comitato etico sarà informato da un rapporto completo che includa tutti i dati clinici e di laboratorio sugli ultimi sei passaggi per ciascun paziente che ha ricevuto l'infusione di cellule t reg come registrato dai team di immunologia, reumatologia ed endocrinologia. La Figura 2 mostra lo schema per le procedure e il follow-up.

Tutti i pazienti saranno sottoposti a quanto segue:

Alla prima visita

• Anamnesi completa ed esame clinico compresa la valutazione della gravità e il punteggio dell'attività clinica della malattia in base al tipo di malattia autoimmune.
• Indagini pretrattamento Emocromo con conta leucocitaria differenziale, linfociti totali, conta dei globuli rossi (RBC), conta piastrinica (PLT), emoglobina (Hb) ed ematocrito (Hct)
• funzionalità epatica, test di funzionalità renale e valutazione degli elettroliti (Na, K e Ca).
• Test di funzionalità epatica: albumina sierica ,PT e INR .bilirubina totale e diretto .AST ,ALT, Fosfatasi alcalina ,Albumina sierica.
• Test di funzionalità renale (creatinina sierica, BUN) ed elettroliti (Na sierico, K e Ca)
• VES e PCR.
• Valutazione della conta delle cellule CD4+CD25+FoxP3+CD127- prima dell'intervento, dopo tre mesi e dopo 6 mesi dall'intervento mediante citofluorimetria.
• Test sierologici per tutti i pazienti: INF-gamma, TNF-alfa, IL-17, IL-2, IL-10 e TGF-beta. Tutte le citochine saranno eseguite mediante test ELISA prima della trasfusione di T reg adottivo, dopo 3 mesi e dopo 6 mesi di trasfusione.
• Indagini radiologiche a seconda del tipo di malattia autoimmune e se indicate.
• Test di laboratorio secondo la malattia autoimmune:

Pazienti affetti da LES:

• Glicemia a digiuno e a 2 ore postprandiale, emocromo completo (CBC), analisi completa delle urine,
• Misurazione delle proteine ​​nelle urine delle 24 h (g/24 h).
• Titolo e pattern di anticorpi antinucleari (ANA) e anticorpi anti-DNA a doppia elica (la misurazione anti-dsDNA sarà effettuata mediante tecnica di immunofluorescenza, dove un titolo di 1/40 o più è considerato positivo)
• Livello del complemento sierico (C3 e C4).

Pazienti T1D:

• Livelli di peptide C a digiuno,
• glicemia a digiuno, HbA1c e
• Verranno misurati i livelli di autoanticorpo T1D [autoanticorpo decarbossilasi dell'acido glutammico (anti-GAD65), autoanticorpo insulina (IAA), anticorpo antigene 2 insulina (IA2) o autoanticorpo zinco trasportatore 8 (anti-ZnT8)].

Per quanto riguarda i prelievi di sangue: il nostro piano per quanto riguarda la frequenza e la quantità di prelievi di sangue come segue:

A- Frequenza:

• Linea di base per CBC, KFT, LFT, elettroliti, dopo 3 mesi e dopo 6 mesi di intervento.
• Rilevamento della conta T reg prima dell'infusione, dopo tre mesi e dopo 6 mesi
• In caso di eventi avversi di grado 2 o superiore.

B- Importo:

• Per la valutazione e la preparazione della linea di base: 6 ml (2 ml * 3 provette). La stessa quantità dopo 3 mesi e dopo sei mesi di infusione di T reg.
• Rilevamento della conta T reg: 4 ml (2 ml* 2 provette) per ematologia e chimica.
• Separazione delle cellule T reg Per la coltura e l'espansione: ( 400ml )
• In caso di eventi avversi: come clinicamente indicato, da 2 ml a 4 ml. Identificazione e conta delle cellule T regolatorie (Treg)(10) L'identificazione e la conta, mediante citometria a flusso, per le Treg umane saranno basate su marcatori cellulari sia positivi che negativi, le Treg umane sono (CD4+, CD25+, CD127-, Foxp3+).

Crioconservazione di Treg espanse:

Per consentire l'infusione del prodotto cellulare più volte, verrà utilizzata la fattibilità della crioconservazione delle Treg. La crioconservazione delle Treg consente flessibilità nell'amministrazione per assistere i percorsi clinici e facilita il completamento di tutti i test di rilascio richiesti. ( 10 ) Somministrazione di cellule T reg e follow-up degli eventi avversi Prima dell'infusione delle cellule verranno esaminati i risultati degli esami ematochimici ed ematologici e verrà raccolta una storia di qualsiasi malattia o febbre recente. I pazienti riceveranno premedicazione con paracetamolo e difenidramina. Poly t regs verrà infuso tramite una linea endovenosa periferica per 10-30 min.

I segni vitali verranno rilevati prima e dopo l'infusione, quindi ogni 15 minuti per almeno 1 ora, quindi ogni ora per le prime 4 ore e ogni 4 ore per 20 ore. Gli esami chimici e l'emocromo completo con emocromo differenziale verranno ripetuti il ​​giorno successivo prima della dimissione dall'unità di ricerca clinica. I pazienti saranno visitati per le valutazioni di follow-up il giorno 4 dopo l'infusione, poi settimanalmente per 4 settimane, poi dopo 13 settimane e poi dopo 26 settimane. Il monitoraggio telefonico per gli eventi avversi continuerà un anno dopo l'infusione, seguito da una visita clinica finale.

La dose di T reg espansa ex vivo sarà la stessa per tutti i pazienti. Verrà somministrato in dosi crescenti di 5x10^6-1x10^8 cellule IV infusione IV infusione. È la dose minima nelle precedenti coorti terapeutiche internazionali per raggiungere la sicurezza (14).

CONSIDERAZIONI ETICHE

1. RISCHI e MINIMIZZAZIONE DEI RISCHI:

   • Possibili rischi dell'imaging medico a ultrasuoni: l'imaging medico a ultrasuoni è un modo rapido e sicuro per valutare i pazienti che non rappresentano alcun rischio e non portano a effetti collaterali. Non portano ad alcun cambiamento nelle condizioni originarie del paziente, ma possono verificarsi rari problemi come: dolore o lividi.
   • Complicanze della venipuntura: formazione di ematomi, danni ai nervi, dolore, emoconcentrazione, stravaso, anemia iatrogena, puntura arteriosa, petecchie, infezione, sincope e svenimento, sanguinamento eccessivo, edema e trombo. Per ridurre al minimo questi rischi sarà assunto in condizioni asettiche da infermieri qualificati.

   • Rischio di infezione: l'isolamento e l'espansione delle cellule T reg saranno effettuati in un ambiente rigorosamente sterilizzato. Durante l'espansione e il controllo di qualità verranno seguite frequenti tecniche di sterilità e verranno eseguiti test di rilascio prima del trasferimento adottivo di cellule T.

     ● Effetti collaterali del prelievo di 400 cc di sangue dai pazienti: come quello della donazione del sangue che sono rari e comprendono lo sviluppo di un ematoma traumatico locale quando si estrae l'ago dalla vena. Mantenere la pressione locale e l'applicazione di ghiaccio o impacchi freddi nell'area può aiutare a prevenire lo sviluppo o la progressione degli ematomi. Questi ematomi sono generalmente piccoli e non causano grossi problemi. Potrebbe anche verificarsi lo sviluppo di vertigini, sudorazione e sincope, che possono essere evitati richiedendo al paziente di sedersi in posizione reclinata per alcuni minuti e, quando possibile, spostandosi lentamente in posizione eretta e spostandosi in un'area in cui gli verrà somministrato qualcosa da mangiare e da bere. L'aumento dell'assunzione di liquidi sarà incoraggiato nelle poche ore successive al prelievo di sangue. Il livello di Hb del paziente non deve essere inferiore a 11 g/dl prima del prelievo del sangue per l'isolamento delle Treg. gli investigatori prepareranno eritrociti confezionati prima del prelievo di sangue da somministrare se indicato clinicamente.

   • Rischio di infezione / infiammazione: l'isolamento e l'espansione delle cellule Treg verranno eseguiti in un ambiente strettamente sterilizzato. Durante l'espansione e il controllo di qualità verranno seguite frequenti tecniche di sterilità e verranno eseguiti test di rilascio prima del trasferimento adottivo di cellule T. I criteri di rilascio accettati includono: fenotipo> 60%, vitalità:> 70%, sterilità e micoplasma negativo.

2. CRITERI DI INTERRUZIONE DAGLI STUDI E DALL'ISCRIZIONE Regole di interruzione di sicurezza per singoli soggetti

   Il trattamento sarà interrotto in qualsiasi soggetto che manifesti uno dei seguenti:

   • Qualsiasi SAE, o un evento avverso di grado 4 clinicamente significativo o un'anomalia di laboratorio di grado 4 confermata per un singolo soggetto, che secondo lo sperimentatore ha una ragionevole possibilità di correlazione con l'infusione di T reg. Sintomi clinici soggettivi che non riflettono una disfunzione d'organo principale, come un forte mal di testa, possono giustificare o meno l'interruzione del trattamento a giudizio dello sperimentatore.
   • I soggetti possono interrompere volontariamente il trattamento o ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento.
   • Possono anche essere rimossi dallo studio in qualsiasi momento se lo sperimentatore determina che continuare lo studio comporterebbe un rischio significativo per la sicurezza del soggetto.
   • Persistente non conformità con i requisiti del protocollo I soggetti che interrompono prematuramente il trattamento in studio devono essere incoraggiati a mantenere lo stesso programma di protocollo e le stesse valutazioni descritte per il follow-up continuo dei dati chiave sui risultati dello studio.

   Studia le regole di arresto

   Questa sperimentazione clinica sarà sospesa per uno dei seguenti motivi:

   • Morte in qualsiasi soggetto in cui si ritenga che la causa della morte abbia una ragionevole possibilità di correlazione con l'intervento dello studio da parte dello sperimentatore.
   • >20% dei soggetti arruolati presenta eventi avversi di grado 3/4 clinicamente significativi o anomalie di laboratorio confermate di grado 3/4 considerate dallo sperimentatore avere una ragionevole possibilità di correlazione con l'intervento dello studio.
   • Gli investigatori informeranno il comitato etico con tutti i dettagli di ciascun paziente incluso nello studio interromperà lo studio una volta che il comitato etico ci informerà di interrompere secondo le regole del comitato.

3. BENEFICI:

   Benefici diretti per i pazienti:

   • Remissione della malattia autoimmune dei pazienti direttamente dalle cellule T regolatorie infuse. Sarà controllato rilevando la gravità della malattia e i punteggi di attività e le indagini di follow-up.
   • Il trasferimento adottivo di cellule T darà una possibilità di controllo ai pazienti con malattie autoimmuni refrattarie.

   Benefici indiretti

   • Il trasferimento adottivo di cellule T reg consente il controllo delle malattie autoimmuni senza soppressione globale del sistema immunitario da parte di farmaci immunosoppressori.
   • Il trasferimento di Treg aiuta nel controllo delle malattie autoimmuni e protegge i pazienti dalla morbilità e mortalità progressiva cronica.
   • Non essere costoso rispetto ad altre opzioni di trattamento lo rende conveniente.
   • Le cellule Treg adottive sono autologhe con minore suscettibilità agli eventi avversi (raggiungimento della sicurezza).
   • Essere una grande speranza per i pazienti con malattie autoimmuni avanzate che sono refrattari al trattamento convenzionale disponibile e non potrebbero raggiungere altre opzioni di trattamento non disponibili elencate nelle linee guida internazionali. In tali stadi avanzati, le cellule T adottive possono offrire un maggiore miglioramento della qualità della vita, della tollerabilità e della compliance dei pazienti.
   • I risultati positivi di questo studio contribuiscono notevolmente al benessere dei cittadini egiziani
   • Aiutare un sottogruppo significativo di pazienti con malattie autoimmuni avanzate con un trattamento a prezzi accessibili ridurrà l'onere finanziario per il governo egiziano.
   • L'offerta di una linea di trattamento così innovativa per i pazienti autoimmuni aumenterà il rango delle università nazionali tra le loro controparti in tutto il mondo
   • Muovere ampi passi in questo campo potrebbe portarci alla stazione di utilizzare il trasferimento adottivo di cellule T per prevenire le malattie autoimmuni prima di completare i criteri per la diagnosi della malattia, o addirittura conservare la tolleranza centrale e prevenire l'insorgenza di queste malattie. Questo sarà considerato un passo da gigante nel campo delle malattie autoimmuni.
4. PRIVACY E RISERVATEZZA Gli investigatori tratteranno in completa riservatezza e nessuno ha il diritto di leggere le informazioni mediche dei nostri pazienti tranne il ricercatore principale. Dopo che la ricerca sarà completata, i risultati della ricerca del nostro paziente e anche ulteriori informazioni sullo stato di salute del nostro paziente saranno informati. La riservatezza delle persone sarà mantenuta in tutti i dati pubblicati e scritti risultanti dallo studio.

5. Alternative alla partecipazione:

   Il paziente ha il diritto di rifiutare o ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento. In caso di rifiuto a partecipare a questa ricerca, il paziente sarà seguito e riceverà il suo trattamento come previsto. Il paziente può interrompere la partecipazione allo studio in qualsiasi momento senza abbondanza o perdita delle cure mediche del paziente.

6. PROCEDURE DI CONSENSO:

Gli ospedali di reumatologia ed endocrinologia (ASU) otterranno un consenso scritto. Il consenso sarà condotto al paziente dal citato sperimentatore durante la prima visita. Le persone alfabetizzate saranno lasciate leggere il consenso seguito dalla sua spiegazione da parte del ricercatore citato, mentre le persone analfabete avranno anche il consenso letto e spiegato loro.